Hommage au Pr Dominique CHOPIN - Signature moléculaire de l'HBP

14 juillet 2006

Mots clés : hypertrophie bégnine de prostate, Marqueur
Auteurs : Alexandre de la Taille, A. Descazeaud, M. Rubin
Référence : Prog Urol, 2005, 15, 6, 1314-1315, suppl. 1

L'hyperplasie bénigne de prostate (HBP) est l'affection la plus fréquente de l'homme âgé. Les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette hyperplasie stromale et épithéliale sont imparfaitement connus. Plusieurs facteurs ont été incriminés dont la testostérone, la dihydrotestostérone, les oestrogènes et les facteurs de croissance.

Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation de l'HBP et de connaître l'impact de certains traitements de l'HBP, l'objectif de ce travail a été d'utiliser la technologie des micropuces à ADNcomplémentaire et des SNP array afin de définir le profil d'expression des gènes spécifique de la prostate normale, de la prostate présentant une HBP et de la prostate soumis à un traitement alpha-bloquant, à un traitement par inhibiteur de la 5alpha réductase et à un traitement par serenoa repens. La réalisation de tissue micro array (TMA) permet ensuite de valider sur un grand nombre d'échantillons l'intérêt du gène candidat, d'identifier les biomarqueurs cliniques et de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

L'ARN a été extrait de 37 échantillons congelés dont 28 HBP et 9 prostates normales, pour être hybridé à des Expressions Arrays explorant le niveau d'expression de 20 000 gènes. L'ARN a ultérieurement été extrait d'un second groupe de 41 échantillons de prostate congelés, et hybridé à des puces à ARN explorant 47 000 gènes. Les niveaux d'expression des gènes ont été évalués par les logiciel SAM, Cluster et Tree View. L'ADN a été extrait de 11 échantillons congelés incluant 7 HBP et 7 prostates normales, pour être hybridé à des SNP Arrays explorant 10 000 SNPs. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel dCHIP qui permet d'analyser le génotype des échantillons, et de rechercher des régions de perte d'hétérozygotie, d'amplification ou de délétion. Des amplifications suspectées sur l'ADN chromosomique ont été validées par Polymerase Chain Reaction quantitative (Q-PCR). Le niveau d'expression protéique de gènes préalablement sélectionnés a été évalué par immunohistochime (IHC) sur des Tissu Micro Arrays (TMA), à l'aide d'un appareil a lecture automatisée ACIS II (Chromavision Medical System, Inc).

Un groupe de gènes différemment exprimés dans l'HBP et le tissu prostatique normal a été mis en évidence : avec un coefficient de surexpression de 3 (Fold Change), 197 gènes sont apparus sus ou sous exprimés dans le groupe HBP, avec une estimation de 19 gènes faussement significatifs, ce qui correspond a un risque d'erreur de 10% (figure 1).

Figure 1 : Profil d'expression génique de l'HBP Les résultats d'expressions Arrays de 17 échantillons d'HBP et 9 échantillons de contrôle (prostate de prélèvements d'organe) sont analysés à l'aide du logiciel SAM (A). La différence d'expression des gènes entre les deux groupes est obtenue sous forme d'une figure. La diagonale bleue sur cette figure représente les valeurs attendues par chance. Les lignes parallèles au dessus et au dessous de cette diagonale définissent le risque accepté, et seuls les gènes situés en dehors de l'espace défini par ces 2 parallèles sont considérés comme significativement différemment exprimés entre les 2 groupes. Ce risque peut être modulé. Le coefficient de surexpression doit également être défini, il correspond à la différence minimale d'expression génique entre les deux groupes prise en compte. Pour chaque couple de valeur (risque d'erreur et coefficient de surexpression), le nombre et la liste de gènes significatifs ainsi que le nombre moyen de faux positifs est exposé. Les points rouges et vert représentent respectivement les gènes significativement sus et sous exprimes dans l'HBP par rapport au groupe contrôle. Avec un coefficient de surexpression de 3 (Fold Change), 197 gènes apparaissent sus ou sous exprimés dans le groupe HBP, avec une estimation de gènes faussement significatifs de19 (risque de 10%). Le logiciel Tree View donne une représentation colorimétriques de l'expression des gènes (B): en rouge sont représentés les gènes sur exprimés, en vert les gènes sous exprimés, et en noir les valeurs intermédiaires.

L'analyse par SNP Arrays n'a mis en évidence aucune anomalie majeure au niveau de l'ADN de l'HBP. Il n'a pas été observé de région de perte d'hétérozygotie, ni de large région d'amplification ou de délétion. Trois gènes, CALD1, PMP22 et BRMS1, ont été sélectionnés sur la base de courtes amplifications suspectées en analyse par SNP Arrays. Ces amplifications n'ont pas été confirmées en Q PCR.

Une courte amplification a été suspectée dans la région du gène EDG3, sur la base des SNPs Arrays. Le nombre de copies de la séquence contenant le SNP rs1573231 (situé dans la région d'EDG3) était significativement plus élevé dans le groupe d'échantillons d'HBP que dans le groupe contrôle (3.9 versus 2.1, p T-test<0.001, figure). Lors de la validation de cette amplification par PCR-Q, le nombre de copies de la séquence contenant le SNP rs1573231 mesuré par PCR Quantitative est apparu significativement plus élevé dans quinze échantillons d'HBP que dans quatre échantillons de contrôle (1.55 versus 1.04, T-test p=0.001). Alors que l'expression génique d'EDG3 évaluée par Expression Arrays était plus élevée dans l'HBP que dans la prostate normale, son niveau d'expression protéique n'était pas significativement différent dans l'HBP en IHC (p= 0.2).

Les modifications d'expression génique attribuables aux traitements médicaux de l'HBP sont en cours d'analyse.

En conclusion, il existe une signature moléculaire spécifique de l'HBP au niveau du transcriptome mais au niveau de l'ADN, aucune différence n'a été mise en évidence. Néanmoins, une amplification courte de l'ADN dans la région du gène EDG3, susceptible d'expliquer une surexpression génique, a été suspectée. L'impact des traitements sur ces gènes spécifiques reste à analyser et les travaux en cours font espérer des résultats prometteurs.

Travail subventionné en partie par l'ARTP (Bourse AFU-ARTP 2004)

Références

- "Pharmacogenomic Analysis of Benign Prostatic Hyperplasia." Descazeaud A, de la Taille A, Setlur S, Hofer M, Chinnayian A, Abbou C, Chopin D, Rubin M J. Urol 2005, 173,45,390#1438

- "Recherche de marqueurs d'hyperplasie bénigne de prostate par étude combinée d'Expression Arrays et de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Arrays." A. Descazeaud, M.A. Rubin, B. Laxman, S. Setlur, L. Schumacher, R. Beroukhim, D.K. Chopin, C.C. Abbou, A. de la Taille Prog. Urol, 2004, 14, 5,51, p 26a#102