Hommage au Pr Dominique CHOPIN - Le Gène p53

14 juillet 2006

Mots clés : génomique, biologie moléculaire
Auteurs : Dominique Chopin, D. Cappellen, François Fradvanyi, Bernard Gattegno
Référence : Prog Urol, 2005, 15, 6, 1338-1343, suppl. 1

Découvert en 1979 par Lane et Crawford, ce gène est le gardien du génome. Le gène p53 est localisé sur le bras court (p) du chromosome 17, au locus 17p13.1, une région sujette à des pertes alléliques et code pour la protéine p53 ou TP53 (Tumour Protein of 53 kilodaltons), une phosphoprotéine nucléaire de 393 acides aminés, qui est un facteur de transcription aux propriétés anti-oncogènes. Celle-ci a été identifiée du fait de son interaction avec des oncoprotéines virales (dont l'antigène du virus SV40, dont les propriétés oncogènes ont été découvertes secondairement).

Le gène p53 est un gène suppresseur de tumeurs : ce rôle transformant a été confirmé par l'inhibition de la croissance in vitro de cellules tumorales par le type sauvage du gène p53.

La protéine p53 issue du gène sauvage est le pivot régulateur central du cycle cellulaire. Lorsque des mutations de l'ADN (acide désoxyribonucléique) sont présentes en grand nombre dans une cellule, le type sauvage de p53 arrête momentanément le cycle cellulaire, en empêchant le franchissement du point de restriction R (passage de G1 à S), afin de permettre à la cellule de réparer les erreurs. Cette action est médiée par la protéine du rétinoblastome pRb et la protéine p21WAF/CIP1, qui inhibent l'activité des enzymes cyclines kinases dépendantes (cdk, pour cyclin dependent kinase). Lorsque les mutations sont trop nombreuses pour être réparées, p53 oriente la cellule vers l'apoptose, par l'intermédiaire du gène Bax.

La protéine p53 issue du gène muté ou inactif (suite à une délétion des gènes de régulation) n'a pas de propriétés anti-oncogènes suite à une altération du site de liaison de l'ADN, la cellule continue à se diviser, même avant la séparation chromatinienne, en accumulant des mutations (instabilité chromosomique et aneuploïdie). Cette instabilité génomique est à l'origine de l'augmentation de l'agressivité tumorale. Le gène p53 est le gène le plus fréquemment muté dans les cancers humains. Paradoxalement, dans les cellules tumorales, il existe souvent une surexpression du gène p53, avec, dans de nombreux cas une accumulation de la protéine p53 anormale qui forme des complexes inactifs avec la protéine p53 normale.

La durée de vie cellulaire est également affectée par l'état de p53. A chacune des divisions cellulaires, la longueur génomique diminue de 50 à 60 nucléotides environ. Les cellules ayant perdu le contrôle de p53 ont une activité réplicative intense mais ne sont pas immortelles. Ces cellules atteignent plus volontiers la crise télomérique (ré-expression de l'activité de la télomérase qui prévient le raccourcissement chromosomique et permet la croissance cellulaire à l'infini) avant leur sénescence ou apoptose.

Après exposition des cellules à des agents génotoxiques tels que les radiations ionisantes, il se produit une augmentation transitoire du taux de p53 par la voie de l'oncoprotéine mdm-2 (murine double minute-2), régulateur négatif de p53. Cette surexpression de p53 peut avoir deux conséquences : l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 ou l'apoptose. Dans le premier cas, les cellules rentrent dans le cycle cellulaire après réparation de leur ADN endommagé ; dans le second, les cellules contenant des altérations sont éliminées. Lorsque p53 n'est pas fonctionnel, les cellules contenant un matériel génétique endommagé peuvent continuer à se multiplier en accumulant des altérations génomiques.

Le gène p53 comporte 20303 paires de bases réparties en 11 exons. La protéine p53 est codée par les exons 2 à 11 du gène p53. La majeure partie codante du gène est concentrée au sein d'une zone de 3066 paires de bases (Figure 5 et Tableau 3).

Figure 5 : Représentation schématique de l'organisation fonctionnelle de la protéine p53. Abréviations : E : Exon ; en chiffres romains, les différents domaines de la protéine p53 ; les chiffres arabes correspondent aux numéros des codons. L'exon 1 et la partie initiale du codon 2 ne sont pas codants. Sous la protéine, sont représentés les sites de reconnaissance et d'interaction ( ) ainsi, TBP : TATA binding protein ; mdm-2 : murine double minute-2 ; E1b : protéine E1b de l'adénovirus 5 ; E6 : protéine E6 du Papillomavirus ; SV40 Tag : antigène T du virus SV40 ; NLS : Signal de localisation nucléaire.

La protéine p53 comporte plusieurs domaines ayant chacun un rôle différent (Figure 5). La région N-terminale (codons 1 à 42) confère à p53 l'activité de facteur de transcription (I : domaine de transactivation). Le domaine central (codons 120 à 290) reconnaît et lie des séquences cibles spécifiques d'ADN grâce à une séquence palindromique de 10 paires de bases. L'extrémité C-terminale (codons 310 à 390) reconnaît des séquences monocaténaires d'ADN endommagé, avec lesquelles elle forme des complexes stables. L'oligomérisation de p53 (p53 est un tétramère) est également régulée par ce même domaine (codons 310 à 350).

Le gène p53 est un bon outil d'étude pour plusieurs raisons :

- les mutations de p53 dans les tumeurs de la vessie sont un événement fréquent (40% à 61%, selon les auteurs :(1);

- l'analyse des bases de données : IARC (International Agency for Research on Cancer) (Figure 6), UMD Necker (Figure 7), indique qu'un nombre important de codons est la cible de mutations inactivant la fonction de la protéine ; il ne s'agit donc pas de polymorphismes génétiques.

Figure 6 : Répartition des mutations du gène p53 dans les tumeurs de la vessie : par type de mutation (d'après la banque de données du CIRC).
Figure 7 : Répartition des mutations du gène p53 dans les tumeurs de vessie par exon et par type (d'après la banque de données UMD Necker, 1998)

- cette distribution reconnaît des cibles préférentielles, localisées à la partie centrale de la protéine (domaine de fixation à l'ADN), les codons 175, 248 et 273. De plus, ces codons peuvent faire l'objet d'événements mutationnels différents, ce qui est d'un grand intérêt épidémiologique.

- étant donné que 90% des altérations sont des mutations ponctuelles, qui, pour des raisons encore peu claires, permettent le maintien d'une protéine p53 entière mais inactive, cette fréquence accrue nous permet de mieux évaluer le résultat produit par des adduits (radicaux greffés sur la molécule d'ADN) générés par une exposition à des agents cancérogènes.

- enfin, 90% des mutations identifiées sont regroupées dans 5 exons, à une petite partie de la molécule.

Les méthodes d'étude du gène et de la protéine p53 sont variées.

La méthode directe correspond à l'analyse de la séquence du gène après extraction de matériel génétique (ADN ou ARN) et amplification par PCR (ou par Reverse Transcriptase-PCR, pour l'ARN). Cette approche utilise habituellement une méthode de screening : S.S.C.P. (Single Strand Conformation Polymorphism) ou D.G.G.E. (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis).

Compte tenu de la lourdeur et du coût de la technique directe, des méthodes indirectes ont été développées. Ainsi, l'immunohistochimie recherche in situ (sur le tissu) la surexpression de la protéine p53. En effet, la protéine p53 issue du gène muté adopte une conformation qui lui confère une demi-vie beaucoup plus longue que la protéine issue du type sauvage de p53 (3 à 6 heures versus 20 mn pour la protéine normale). On peut toutefois observer une surexpression sans mutation (par exemple, par la surexpression de la protéine de liaison mdm-2) ou, à l'inverse, l'absence de surexpression en cas de mutation (par exemple, si celle-ci intéresse le domaine de liaison à l'ADN (2, 3). Toutefois, on peut estimer que dans plus d'un cas sur deux (70%) une surexpression de p53 est associée à une mutation du gène p53.

Dans le cas de mutation de p53, il est également possible de mettre en évidence dans le sérum des auto-anticorps anti-p53 en utilisant un test immuno-enzymatique (ELISA, pour Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Par ailleurs, le test fonctionnel à la levure réalise une approche indirecte tout à fait intéressante : ce test utilise une levure (Saccharomyces Cerevisiae) mutante car déficiente pour le métabolisme de l'adénine (ade-), ce qui lui confère une coloration rouge par accumulation d'un métabolite. L'introduction de la protéine p53 native restaure le phénotype ade+ et conduit à la coloration blanche, indiquant ainsi que la p53 introduite est fonctionnelle. L'introduction d'une p53 issue du gène p53 muté ne permettant pas l'activation du gène ade, la levure restera rouge.

- Anomalies de p53 et cancer de la vessie

Les premières études concernant p53 ont montré la fréquence des anomalies de ce gène dans le cadre du cancer vésical.

Les anomalies du gène p53 ont été abordées par des techniques de biologie moléculaire, d'immunohistochimie et de sérologie. Ces anomalies génétiques ont été étudiées principalement par SSCP et analyse de séquence. Dans le cas du cancer de la vessie comme dans d'autres tumeurs solides, les mutations sont surtout observées dans les exons 5 à 8. Schématiquement, il existe deux grands types de tumeurs vésicales quant à leur contexte étiologique : les tumeurs urothéliales ou carcinomes à cellules transitionnelles qui peuvent être induites par le tabac et les carcinogènes, de l'environnement d'une part, et les tumeurs épidermoïdes liées à l'infection de la paroi vésicale par le schistosome.

En ce qui concerne les tumeurs urothéliales où l'agression du matériel génétique est exogène, la prévalence des mutations est de 34%. Les substitutions de base (transversion ou transition) se répartissent de la façon suivante : G : Cð A : T37%, G :

Cð T : A 4%, G : CðC : G 21%, A : TðG : C 0%, A : T ð T : A 3%, A : Tð C : G 2%, délétion/insertion 14%, transition aux nucléotides CpG 16%. Le codon 280 est particulièrement siège de mutations. A l'opposé, les tumeurs vésicales épidermoïdes induites par le schistosome se caractérisent par une fréquence des transitions sur les dinucléotides CpG probablement du fait de l'action délétère du N0 lié à l'inflammation produite par les oeufs de schistosomes (4).

Les études immunohistochimiques (IHC) sont basées sur le fait que la protéine mutante adopte une conformation qui la rend détectable car sa demi-vie est augmentée. Il existe d'autres mécanismes qui expliquent que la protéine p53 puisse être altérée sans modification génétique, en particulier la liaison avec d'autres protéines. L'intérêt de l'IHC est une indication rapide de l'état de la protéine p53 (5, 6). Il est actuellement clairement établi que 25% des tumeurs vésicales présentent une surexpression de la protéine p53 sans qu'une mutation n'ait été mise en évidence, dans 10% des cas, il existe des mutations sans anomalie immunohistochimique.

Malgré l'absence de concordance exacte entre les mutations et l'immunohistochimie (IHC), cette dernière technique a été utilisée comme outil du pronostic en complément des critères clinicopathologiques. L'IHC permet de mettre en évidence une surexpression nucléaire liée à une augmentation de la demi-vie. Plusieurs anticorps sont disponibles reconnaissant des immunodominants sur l'extrémité N ou C terminale de la protéine. Il est possible d'apprécier un seuil de positivité correspondant au nombre de noyaux marqués. Seul ce marquage est habituellement considéré comme ayant une signification dans les études anatomocliniques.

Utilisant cette méthode, les premières études (tableau 4) ont fournit des renseignements controversés. Dans ces études, le marquage de p53 était principalement confronté à la progression et les analyses multivariées n'ont pas montré d'intérêt de ce paramètre par rapport au stade. Une limite de ces études négatives, était certainement le nombre de patient ou les caractéristiques rétrospectives de la cohorte (recrutement sur plusieurs années avec des modifications dans l'évaluation du stade et les thérapeutiques. Dans une deuxième vague de travaux, sur un plus grand nombre de patients, émerge un groupe de travaux qui suggère un intérêt pronostique pour les anomalies de p53 (tableau 5). Ces études en effet, démontrent non seulement l'intérêt en ce qui concerne la progression, mais aussi la survie spécifique, dans le cadre d'analyses multivariées.

Ces travaux avec un plus grand recul confirment les données des études initiales pour les groupes ayant décrit une corrélation positive. Ces données sont suffisamment importantes pour envisager l'analyse prospective de ces marqueurs. Certains auteurs ont montré que l'analyse de p53 était un élément prédictif de la réponse au BCG (7, 8).

Les anomalies de p53 ont été décrites sur les cellules exfoliées vésicales (9, 10). Il est possible de détecter les mutations du gène p53 sur les cellules obtenues après lavage vésical avec une assez bonne corrélation avec l'analyse faite sur la tumeur. Les anomalies ainsi détectées pouvaient précéder la récidive d'un délai d'environ 6 mois. Le développement de techniques non invasives est certainement un point important si l'utilité de ce marqueur est confirmé (11).

- p53 du laboratoire à la clinique

A l'évidence p53 est un marqueur ayant un intérêt clinique, de par son rôle fonctionnel et par la relation entre les anomalies de ce gène et la progression tumorale. Sur le plan pratique, les études histochimiques et l'analyse des cellules vésicales exfoliées sont réalisables dans des laboratoires cliniques sans geste invasif complémentaire chez ces patients. Une étape à la diffusion de ces analyses est la validation de leur reproductibilité sur le plan méthodologique en particulier la façon d'apprécier la positivité du marquage et la définition du seuil de positivité. L'influence des méthodes de recueil et de fixation des tissus doivent être standardisées (12).

Sans la standardisation de la détection des anomalies de p53, aucune recommandation d'utilisation ne pourra être envisagée. Parallèlement, le rôle de p53 par rapport aux autres marqueurs des tumeurs vésicales doit être mené afin de ne retenir que les marqueurs les plus indicatifs du pronostic (13).

Références

1. Cordon-Cardo, C., Dalbagni, G., Saez, G. T., Oliva, M. R., Zhang, Z. F., Rosai, J., Reuter, V. E., and Pellicer, A. p53 mutations in human bladder cancer: genotypic versus phenotypic patterns. Int J Cancer, 56: 347-353, 1994.

2. Vet, J. A., Bringuier, P. P., Schaafsma, H. E., Witjes, J. A., Debruyne, F. M., and Schalken, J. A. Comparison of P53 protein overexpression with P53 mutation in bladder cancer: clinical and biologic aspects. Lab Invest, 73: 837-843, 1995.

3. Popov, Z., Hoznek, A., Colombel, M., Bastuji-Garin, S., Lefrere-Belda, M. A., Bellot, J., Abboh, C. C., Mazerolles, C., and Chopin, D. K. The prognostic value of p53 nuclear overexpression and MIB-1 as a proliferative marker in transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer, 80: 1472-1481, 1997.

4. Warren, W., Biggs, P. J., el-Baz, M., Ghoneim, M. A., Stratton, M. R., and Venitt, S. Mutations in the p53 gene in schistosomal bladder cancer: a study of 92 tumours from Egyptian patients and a comparison between mutational spectra from schistosomal and non-schistosomal urothelial tumours. Carcinogenesis, 16: 1181-1189, 1995.

5. Moore, L. E., Smith, A. H., Eng, C., DeVries, S., Kalman, D., Bhargava, V., Chew, K., Ferreccio, C., Rey, O. A., Hopenhayn, C., Biggs, M. L., Bates, M. N., and Waldman, F. M. P53 alterations in bladder tumors from arsenic and tobacco exposed patients. Carcinogenesis, 24: 1785-1791, 2003.

6. Esrig, D., Spruck, C. H., 3rd, Nichols, P. W., Chaiwun, B., Steven, K., Groshen, S., Chen, S. C., Skinner, D. G., Jones, P. A., and Cote, R. J. p53 nuclear protein accumulation correlates with mutations in the p53 gene, tumor grade, and stage in bladder cancer. Am J Pathol, 143: 1389-1397, 1993.

7. Lacombe, L., Dalbagni, G., Zhang, Z. F., Cordon-Cardo, C., Fair, W. R., Herr, H. W., and Reuter, V. E. Overexpression of p53 protein in a high-risk population of patients with superficial bladder cancer before and after bacillus Calmette-Guerin therapy: correlation to clinical outcome. J Clin Oncol, 14: 2646-2652, 1996.

8. Popov, Z., Hoznek, A., Colombel, M., Bastuji, S., Abbou, C. C., and Chopin, D. K. [Evaluations of protein p53 overexpression in cancer of the bladder: prognostic value]. Chirurgie, 121: 461-469, 1996.

9. Sidransky, D., Von Eschenbach, A., Tsai, Y. C., Jones, P., Summerhayes, I., Marshall, F., Paul, M., Green, P., Hamilton, S. R., Frost, P., and et al. Identification of p53 gene mutations in bladder cancers and urine samples. Science, 252: 706-709, 1991.

10.Sidransky, D. and Messing, E. Molecular genetics and biochemical mechanisms in bladder cancer. Oncogenes, tumor suppressor genes, and growth factors. Urol Clin North Am, 19: 629-639, 1992.

11.Vet, J. A., Witjes, J. A., Marras, S. A., Hessels, D., van der Poel, H. G., Debruyne, F. M., and Schalken, J. A. Predictive value of p53 mutations analyzed in bladder washings for progression of high-risk superficial bladder cancer. Clin Cancer Res, 2: 1055-1061, 1996.

12.McShane, L. M., Aamodt, R., Cordon-Cardo, C., Cote, R., Faraggi, D., Fradet, Y., Grossman, H. B., Peng, A., Taube, S. E., and Waldman, F. M. Reproducibility of p53 immunohistochemistry in bladder tumors. National Cancer Institute, Bladder Tumor Marker Network. Clin Cancer Res, 6: 1854-1864, 2000.

13.Chopin, D. [p53 and prognosis of urothelial bladder tumors]. Pathol Biol (Paris), 45: 893-897, 1997.