Étude in vitro de l'activité litholytique de quatre plantes médicinales vis-à-vis des calculs urinaires de cystine

25 janvier 2011

Auteurs : F. Meiouet, S. El Kabbaj, M. Daudon
Référence : Prog Urol, 2011, 1, 21, 40-47




 




Introduction


La lithiase cystinique représente environ 1 % des calculs chez l’adulte et 10 % chez l’enfant [1]. Elle résulte d’une anomalie de transport rénal et intestinal de la cystine et des acides aminés dibasiques qui se traduit par une fuite rénale de ces aminoacides et, au plan clinique, par une cristallisation de la cystine dans l’appareil urinaire à l’origine de calculs multirécidivants [2], voire d’une altération de la fonction rénale [3]. Malgré les progrès considérables des techniques urologiques, la prise en charge de la lithiase cystinique reste difficile car cette variété chimique de lithiase possède une résistance particulière aux ondes de choc extracorporelles et, par ailleurs, un niveau de récidive élevé nécessitant une multiplication des gestes urologiques.

Au Maroc, le recours à la phytothérapie remonte à plusieurs siècles, et certaines plantes médicinales sont utilisées d’une manière traditionnelle pour le traitement des calculs urinaires. Parmi les plantes antilithiasiques les plus réputées, on trouve : Herniaria hirsuta L. (caryophyllacées), les fleurs d’Opuntia ficus-indica (cactacées) ou fleurs du figuier de barbarie, les styles de Zea mays (fabacées) et les graines de l’Ammi  visnaga L. (apiacées). Leurs propriétés antilithiasiques ont été mises en évidence par l’expérience et ne se sont jamais trouvées démenties par l’usage. Certains constituants d’Hhirsuta L. ont été identifiés et incluent flavonoïdes, coumarines, tanins et saponines mono- et bidesmosidiques [4]. Cependant, le composant actif dans la prévention de la lithiase n’a pas encore été identifié. Les expériences conduites par Atmani in vitro [5] et in vivo [6] avec les extraits d’Hhirsuta L. vis-à-vis de la cristallisation oxalocalcique ont montré l’activité inhibitrice de la plante. Récemment, ces auteurs [7] ont également montré la capacité de l’extrait d’Herniaria à enrober les cristaux d’oxalate de calcium et à bloquer ainsi leur adhésion aux cellules rénales.

L’objectif de l’étude rapportée ici était :

de mettre au point un protocole standardisé pour la mise en évidence in vitro du pouvoir de dissolution des calculs urinaires composés de cystine à l’aide d’extraits aqueux des plantes antilithiasiques évoquées ci-dessus ;
d’étudier les aspects cinétiques de cette dissolution.


Matériel et méthodes


Les calculs urinaires


Les calculs de cystine ont été collectés chez différents patients souffrant de cystinurie congénitale et ont été sélectionnés selon leur type morphologique Va ou Vb [8], le type Va étant environ dix fois plus fréquent que le Vb. Les calculs ont été recueillis par chirurgie, par néphrolithotomie percutanée ou après expulsion spontanée et leur composition chimique a été authentifiée par analyse infrarouge. Leur poids variait de 11,23 à 20,86mg pour les calculs de type Va et de 55,14 à 93,54mg pour ceux de type Vb.


Le matériel végétal


Hhirsuta L. est une plante de la région de Taza au Nord-Est du Maroc. Elle a été utilisée dans son intégralité.

Les fleurs d’O. ficus-indica provenaient de la région de Rabat.

Les styles de Zmays étaient également originaires de la région de Rabat.

Les graines de l’Avisnaga provenaient de la région de Fès.

Les fleurs d’O. ficus-indica , les styles de maïs et la plante entière d’Hhirsuta L. ont été séchés à l’abri de la lumière dans un endroit sec et aéré puis ont été réduits en poudre avant de subir l’extraction à chaud. De même, les graines de l’Avisnaga, une fois séchées, ont été moulues et ensuite extraites selon la méthode décrite ci-dessous.


Méthode d’extraction


Pour chaque plante, l’extrait a été préparé par infusion, pendant 30minutes, de 2g de poudre dans 100ml de solution aqueuse de chlorure de sodium (NaCl) à 9g/L préalablement portée à ébullition. Chaque extrait a ensuite été filtré d’abord à travers un filtre Sartorius (référence 16488, Fisher scientific) puis à travers un filtre seringue Sartorius (référence 11754, Fisher scientific) fixé sur un flacon de filtration de 30ml (référence 309650, Bioblock).


Références


L’effet des extraits de plantes a été comparé à celui :

d’une solution aqueuse de citrate de sodium à 3mmol/L, qui correspond à la concentration moyenne de citrate urinaire obtenue lors du traitement de la cystinurie par alcalinisation des urines (2,91mmol/L dans notre expérience) ;
d’une solution aqueuse de NaCl à 9g/L utilisée comme solution témoin.


Méthode d’évaluation de l’activité de dissolution


Effet des extraits de plantes sur les calculs de cystine de type Va


La première expérience a consisté à comparer les effets des quatre plantes en mettant les calculs et fragments de calculs de cystine de type Va en présence de 20ml d’extrait de plante à température ambiante sous agitation magnétique (500rpm).

L’exposition des calculs aux extraits aqueux n’entraînant pas de modifications perceptibles ni après 24 heures ni après trois jours, les calculs ont été laissés au contact des extraits pendant huit semaines, période qui correspond à la durée de traitement recommandée en médecine traditionnelle. Tous les 15 jours, ils ont été sortis du milieu expérimental, lavés à l’eau distillée, séchés à 40°C durant 16 heures, puis pesés à l’aide d’une balance de précision au 100e de milligramme (Sartorius) pour évaluer la perte de masse et ensuite replacés dans le milieu pendant les 15 jours suivants. Les pesées ont été réalisées au bout de deux, quatre, six et huit semaines (S2 à S8).

Chacune des expériences a été répétée trois fois dans les mêmes conditions et les résultats ont été exprimés en calculant la moyenne et l’écart-type des valeurs obtenues.

À j0, le poids moyen (±écart-type) des fragments de calculs de type Va était de :

13,12±1,97mg avec les fleurs d’O. ficus-indica  ;
17,10±0,73mg avec Hhirsuta  ;
15,91±0,04mg avec Avisnaga  ;
16,23±4,6mg avec Zmays  ;
18,85±0,33mg avec la solution de NaCl ;
16,69±5,37mg avec la solution de citrate.


Dissolution des calculs de type Vb


L’extrait des fleurs d’O. ficus-indica a été testé en présence de calculs de type Vb dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment.


Étude de la relation dose/effet


Une étude de la relation dose/effet a été réalisée avec les extraits des fleurs d’O. ficus-indica par dilutions au demi et au quart de l’extrait initial préparé à partir de 20g/L de poudre de plante.


Évaluation de la capacité des extraits aqueux des plantes à dissoudre les calculs urinaires


L’activité des extraits a été évaluée en calculant le taux de dissolution des calculs après séjour dans le milieu expérimental en comparant le poids résiduel des calculs par rapport à leur poids initial avant l’incubation avec l’extrait. Le pourcentage de dissolution a été calculé par la formule [9] :
a%=(Winitial−Wfinal)×100/Winitial,où : a  % est le taux de dissolution du calcul et W initial et W final sont les poids du calcul avant et après l’incubation avec les extraits de plantes.


Résultats


Les extraits de plantes se sont révélés qualitativement et quantitativement plus actifs que les solutions de NaCl à 9g/L et de citrate de sodium utilisées comme référence.


Étude comparative de l’activité des extraits de plantes sur les calculs de type Va


La capacité de dissolution des calculs par les différents extraits durant huit semaines est illustrée par la Figure 1. L’extrait de styles de maïs avait un effet légèrement plus marqué que les autres puisque, à S2, il provoquait 68±10,4 % de réduction de la masse du calcul alors que les extraits de fleurs d’O. ficus-indica , de graines d’Avisnaga et de plante entière H.  hirsuta entraînaient respectivement une perte de poids de 52±13,1, 58±27,4 et 56±7,1 %, le citrate et la solution de NaCl donnant une réduction de la masse du calcul de 11±4 et 17±1 %, respectivement. À S4, la dissolution était complète avec l’extrait des styles de maïs, la perte de masse s’élevant à 92±8,5, 91±9,5 et 83±6 % avec les extraits d’Avisnaga, d’O. ficus-indica et d’H.  hirsuta respectivement. Avec le citrate et l’eau physiologique, la perte de masse n’était que de 13±4,5 et 18±1 %, respectivement. À S6, la solubilisation des calculs était totale avec l’extrait d’Avisnaga. En présence d’O.  ficus-indica et d’H.  hirsuta, la perte de masse des calculs atteignait 97±4,6 et 95±3,5 % et seulement 15±6 % avec la solution de citrate et 19±1 % avec NaCl à 9g/L. À S8, la dissolution était totale avec les extraits d’O.  ficus-indica et d’H.  hirsuta alors qu’avec la solution de citrate et la solution de NaCl, la perte de poids des calculs était respectivement de 18±8 et de 20±1,5 %.


Figure 1
Figure 1. 

Effet des quatre extraits de plantes médicinales, du citrate de sodium 3mmol/L et de la solution de NaCl à 9g/L sur la dissolution in vitro des calculs de cystine de type Va.




Évolution du pH durant les expériences


Le pH initial des solutions (Figure 2) variait de 4,63 pour l’extrait de fleurs d’O. ficus-indica à 5,31 pour l’extrait d’Avisnaga , 6,05 pour l’extrait d’Hernaria hirsurta et 6,3 pour l’extrait de Zmays . Il était sensiblement plus élevé (pH 7,22) pour la solution de citrate à 3mmol/L. La solution de NaCl à 9g/L avait un pH de 5,98. Pendant les huit semaines de l’expérience, le pH de tous les milieux, à l’exception du NaCl à 9g/L, avait tendance à augmenter. À S8, le pH des différents milieux était le suivant :

6,38±0,33 avec O.  ficus-indica  ;
6,96±0,21 avec Avisnaga  ;
6,63±0,05 avec Hhirsuta  ;
7,15±0,33 avec Zmays  ;
7,95±0,25 avec le citrate à 3mmol/L ;
5,25±0,82 avec NaCl à 9g/L.


Figure 2
Figure 2. 

Évolution du pH des extraits des plantes lors du screening en présence des calculs de cystine de type Va.




La Figure 2 illustre l’évolution du pH aux différents stades de l’expérience.


Étude de l’activité des extraits de plantes sur les calculs de type Vb


Le nombre de calculs Vb disponibles étant plus faible que celui des calculs Va, seul l’extrait d’O. ficus-indica à 20g/L a pu être testé. Les résultats montrent une progression significative de perte de masse pour les trois calculs testés dont le poids est passé de 73,27±19,28mg à j0 à 17,96±9,4mg à S8. Par ailleurs, un seul calcul Vb a pu être mis en présence de citrate de sodium ou en présence d’eau physiologique.

Comme le montre la Figure 3, le pourcentage de dissolution avec l’extrait s’élevait à 20±3,8 % à S2, 48±3,5 % à S4, 64±9,8 % à S6 et 78±6,6 % à S8. En présence du citrate de sodium et de la solution saline, la masse des calculs a très peu varié entre j0 et S8, passant respectivement de 64,69 à 61,25mg (−5,3 %) et de 75,15 à 66,95mg (−11 %).


Figure 3
Figure 3. 

Évolution du pourcentage de perte de poids des calculs de type Vb en présence de l’extrait de l’Opuntia ficus-indica.




Le pH en présence de l’extrait d’O. ficus-indica à 20g/L augmentait de 4,63 (à j0) à 7,66±0,57 en fin d’expérience (S8).


Effet-dose de l’extrait de l’O. ficus-indica en présence des calculs de cystine de type Va


D’autres essais ont été réalisés pour tester la dose la plus efficace de l’extrait des fleurs d’O.  ficus-indica pour la dissolution des calculs de cystine (Figure 4). L’extrait à 20g/L était le plus efficace, permettant d’obtenir 52±13,1 % de dissolution à S2 contre 24±17 et 17±11 % pour les concentrations à 10 et 5g/L, respectivement. À S4, l’extrait à 20g/L engendrait 91±9,5 % de solubilisation et les concentrations à 10 et 5g/L entraînaient 48±24,2 et 43±3,6 % de dissolution, respectivement. À S8, les calculs étaient entièrement dissous en présence de l’extrait à 20g/L alors que les extraits à 10 et 5g/L avaient provoqué respectivement 86±24 et 76±2,5 % de diminution de poids du calcul. Le citrate et la solution de NaCl avaient permis de réduire la masse des calculs de 18±8 et 20±1,5 % respectivement durant la période d’étude.


Figure 4
Figure 4. 

Évolution de la dissolution des calculs de cystine de type Va en fonction des doses de l’extrait des fleurs d’Opuntia ficus-indica.





Discussion


La solubilité urinaire de la cystine (PM=240 Da) ne dépasse pas 250mg/L (soit 1mmol/L) à un pH inférieur à 7, mais atteint 500mg/L à partir d’un pH de 7,5 [10]. Le traitement médical de la cystinurie a pour objectif de maintenir soluble la cystine libre en agissant principalement sur sa concentration urinaire et sur le pH des urines. En cas d’échec du traitement de base qui comporte un réajustement diététique pour limiter l’apport en méthionine et en sel, une hyperdiurèse pour diminuer la concentration de la cystine et une alcalinisation pour accroître sa solubilité, l’emploi d’agents pharmacologiques supplémentaires à base de sulfhydryles peut s’avérer nécessaire. Cependant, leurs nombreux effets secondaires (intolérance gastro-intestinale, stomatite, rash cutané, pemphygus, arthralgies, polymyosite, protéinurie, syndrome néphrotique, thrombopénie, voire aplasie médullaire) limitent leur utilisation au long cours [11].

Des études in vitro[12] ont été réalisées en présence de calculs de cystine et de différents agents chimiques litholytiques ou non comme la N -acétyl-cystéine, la d-pénicillamine, la trisamine, l’alpha-mercaptopropionyl-glycine et le bicarbonate de sodium. La comparaison de l’activité de ces produits a confirmé la relation entre la vitesse de dissolution des calculs et le pH de la solution. Ainsi, la trisamine (pH=10,73) est significativement plus efficace que le bicarbonate de sodium (pH=7,89). Cependant, une solution pure de N -acétyl-cystéine à 0,6M (pH=1,74) est un meilleur milieu solvant de la cystine que la même solution combinée avec la trisamine (pH=3,78). De même, la capacité de solubilisation d’une solution 0,3M de N -acétyl-cystéine est fortement augmentée lorsqu’elle est alcalinisée par l’addition de soude et de trisamine (pH final=9,0), témoignant de l’action synergique entre le groupement thiol de la N -acétyl-cystéine et le milieu fortement basique.

L’ensemble de ces observations est cohérent avec les propriétés physicochimiques de la cystine dont les pKa sont égaux à 1 et 1,7 et les pKb égaux à 7,48 et 9,02, rendant la molécule de cystine plus ionisable et, par conséquent, beaucoup plus soluble dans l’eau lorsque le milieu est nettement acide (conditions non physiologiques) ou au contraire alcalin.

Par ailleurs, le mode d’action [13] des sulfhydryles s’explique par une réaction de substitution nucléophile entre la molécule de cystine et le sulfhydryle favorisant ainsi l’augmentation de la vitesse de solubilisation de la cystine : à pH alcalin par exemple, la d-pénicillamine perd un proton, ce qui facilite la réaction d’échange avec formation d’un disulfure mixte cystéine-d-pénicillamine (Figure 5) qui est 50 fois plus soluble que la cystine elle-même.


Figure 5
Figure 5. 

Réaction d’échange entre la d-pénicillamine ayant perdu un proton et la molécule de cystine.




In vitro, les composés sulfhydrylés ont un potentiel de dissolution de la cystine nettement supérieur à l’alcalinisation isolée. Leur efficacité spontanée est quasiment comparable, mais en milieu alcalin, la N -acétyl-cystéine est beaucoup plus performante que la d-pénicillamine ou la mercaptopropionylglycine. Cependant, la pharmacocinétique de la N -acétyl-cystéine n’est pas compatible avec un traitement par voie orale ou systémique [3].

L’emploi des plantes médicinales pour dissoudre les calculs de cystine nous a paru une alternative intéressante et les tests réalisés in vitro en présence des différents extraits ont montré une cinétique de solubilisation largement supérieure des extraits par rapport au sérum physiologique et au citrate de sodium et cela en présence des deux types morphologiques Va et Vb. Le pouvoir dissolvant des extraits des styles de maïs, des fleurs d’O. ficus-indica, d’H.  hirsuta et de l’Avisnaga sur les calculs de cystine résulte d’une interaction entre la cystine et les molécules présentes dans ces plantes et extraites au cours du processus d’infusion.

L’analyse de la littérature montre que les styles de Zmays sont constitués de polyphénols de type tanins (environ 12 %) et sont riches en potassium [13]. H.  hirsuta contient des saponosides (3–9 %) sous forme de dérivés d’acides médicagéniques [14] et de saponosides bidesmosidiques [15, 16] ainsi que des flavonoïdes (0,2–1,2 %) constitués principalement de l’isorhamnétol et du quercétol. Les graines de l’Avisnaga sont composées surtout de furanochromes [17] (2–4 %) sous forme de khelline, visnagine, norvisnagine, et de khellol et son glucoside, de khelléline, khellinol, ammiol, et son glucoside[18], visammiol, khellinone, visnaginone et aussi des pyranocoumarines [19] (0,2–0,5 %) représentées par la visnadine, la samidine, la dihydrosamidine. Les flavonoïdes sont également présents sous forme de quercétine, d’isorhamnétol, et de kaempférol. Quant aux fleurs d’O. ficus-indica , elles se révèlent surtout constituées de flavonoïdes : pendulétine, rutine, quercétine, lutéoline.

L’examen de l’ensemble des constituants chimiques présents dans les différentes plantes utilisées suggère qu’un mécanisme d’action indépendant du pH est responsable de l’effet solvant constaté. Cet effet pourrait être lié à la formation de complexes cystine-principe actif, par exemple cystine-flavonoïdes, cystine-tanins ou encore cystine-sapogénines bidesmosidiques dont la stabilité serait assurée par des liaisons hydrogènes et des liaisons hydrophiles entre les groupements fonctionnels des principes actifs et les fonctions carboxyliques ou amines de la molécule de cystine (Figure 6). Les complexes formés seraient beaucoup plus solubles que la cystine elle-même, entraînant ainsi la dissolution des calculs tout en maintenant en solution des quantités parfois élevées de cystine dissoute.


Figure 6
Figure 6. 

Mécanisme d’action proposé pour la dissolution des calculs de cystine par les principaux constituants des plantes médicinales.




Par ailleurs, l’extrait d’O. ficus-indica dissolvait aussi bien les calculs de type Va que de type Vb alors que les travaux de Bhatta et al. [20] ont montré que l’efficacité du traitement urologique des calculs de cystine dépendait de leur structure cristalline. Selon ces auteurs, les calculs de cystine-S (« Smooth ») (type Vb de notre classification) observés au microscope électronique révèlent une surface constituée de petits cristaux disposés irrégulièrement. Ces calculs sont plus résistants à la lithotripsie extracorporelle que les calculs de cystine-R (« Rough ») (type Va de notre classification) dont la structure est constituée d’hexagones empilés. Nos observations suggèrent que la dissolution des calculs de cystine par les extraits de plantes est un processus dont le mécanisme est probablement indépendant de l’état de surface du calcul, ce qui pourrait expliquer l’efficacité observée de l’extrait d’O.  ficus-indica sur les deux types de calculs.


Conclusion


Les résultats des expériences de dissolution in vitro des calculs de cystine ont démontré l’efficacité des extraits d’H.  hirsuta , des fleurs d’O. ficus-indica , des graines de l’Avisnaga et des styles du maïs. Ces extraits pourraient donc constituer un traitement curatif et/ou prophylactique intéressant pour les patients cystinuriques.


Conflit d’intérêt


Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêt.



 Niveau de preuve : 4.




Références



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