Effet du pré-conditionnement ischémique et de la vitamine Csur la reprise fonctionnelle des reins ischémiques

11 juillet 2007

Mots clés : Transplantation, Rein, ischémique, reperfusion, vitamine C.Niveau de preuve : 3
Auteurs : MAHFOUDH-BOUSSAID A., BADET L., ZAOUALI A., SAIDANE-MOSBAHI D., MILED A., BEN ABDENNEBI H.
Référence : Prog Urol, 2007, 17, 836-840
But : Présenter les résultats du pré-conditionnement ischémique (PCI), du pré-conditionnement pharmacologique induit par la vitamine C (Vit C) et de l'association des deux conditionnements sur la reprise fonctionnelle des reins de rats après une ischémie chaude prolongée. Matériel :Nous avons utilisé 46 rats répartis en 5 groupes expérimentaux. Les reins du groupe sham (n=9) subissent uniquement une dissection du pédicule. L'ischémie (60 min, n=10) est induite par le clampage des deux reins. Le PCI (n=9) consiste en deux cycles successifs (5 min/5 min) d'ischémie/reperfusion (I/R). La Vit C (100 mg/Kg, n=9) est administrée par voie intraveineuse 30 min avant l'I chaude. Le groupe Vit C+PCI (n=9) est l'association des deux traitements. La malonedialdéhyde (MDA) tissulaire, la lactate déshydrogénase (LDH) plasmatique, le taux de réabsorption de sodium (TRNa) et la clairance de la créatinine (DFG) sont évalués après 120 min de reperfusion des reins.
Résultats : Les reins ischémiques montrent une augmentation significative des concentrations de MDA et de LDH et une diminution significative du DFG et du TRNa, par comparaison au groupe sham. L'utilisation du PCI ou de la Vit C entraïne une amélioration significative de la fonction rénale, par rapport au groupe ischémie. L'association Vit C+PCI montre une légère amélioration des paramètres expérimentaux par rapport à ceux du groupe ischémie, mais n'améliore pas le fonctionnement des reins par rapport à une utilisation séparée du PCI ou de la Vit C.
Conclusion : Le PCI et la Vit C améliorent les paramètres fonctionnels des reins ischémiques. Cependant, les effets protecteurs sont atténués lorsque les deux traitements sont associés.

La survenue des lésions cellulaires après une ischémie est caractérisée par la diminution des réserves d'adénosine triphosphate (ATP), l'altération de la distribution des fluides et l'oedème cellulaire, l'augmentation de la concentration intracellulaire de calcium, l'acidose intracellulaire, et la perte des fonctions de synthèse de la cellule [1]. La reperfusion suivant un épisode ischémique est une attaque brutale contre la cellule. Elle est engendrée par la libération de divers produits toxiques comme les radicaux libres oxygénés (RLO) et les cytokines pro-inflammatoires. L'addition de tous les évènements du syndrome d'ischémie/reperfusion (I/R) est en conséquence responsable de la mort cellulaire par nécrose ou apoptose. La reprise retardée de la fonction rénale (RRF) est la conséquence habituelle des lésions d'I/R des reins. Elle est caractérisée par la nécrose des cellules tubulaires, entraïnant la destruction de la barrière de perméabilité épithéliale et l'obstruction tubulaire, par accumulation de débris cellulaires et protéiniques dans les tubes rénaux [2]. La physiopathologie de cette RRF implique de multiples processus ce qui limite l'efficacité de la prévention et/ou des traitements[3].

Il existe un consensus général pour admettre que plus l'intervention sera tardive moins les lésions d'I/R seront réversibles. Un des modes d'intervention possibles consiste à préparer l'organe à une période d'ischémie prolongée par un pré-conditionnement ischémique ou pharmacologique. Le pré-conditionnement ischémique (PCI) consiste à exposer l'organe à des courtes périodes d'I/R avant une ischémie prolongée. L'efficacité de cette stratégie est bien décrite pour le coeur [4] et le foie [5] alors que pour le rein les données de la littérature sont parfois contradictoires [6, 7]. Plusieurs auteurs ont néanmoins montré que le PCI a, à court terme, un effet bénéfique sur la réponse cellulaire au stress oxydatif par une activation de la NO synthase, une modification de la cascade des "mitogen-activated protein" (MAP) kinases (qui s'accompagne d'une modulation de l'expression de NF-kappa B et donc de la réponse inflammatoire [6]) et d'une réduction de la production des radicaux libres propre à moduler l'apoptose des cellules glomérulaires et tubulaires [8].

La protection induite par le PCI a été démontrée essentiellement dans les modèles animaux, son application clinique pourrait permettre la mise en place d'approches thérapeutiques importantes. Dans le domaine de l'urologie, l'utilisation du PCI pourrait diminuer les lésions tissulaires lors de la reperfusion et améliorer la reprise de fonctions des greffons rénaux. Il pourrait également trouver une indication potentielle lors de la réalisation de néphrectomie partielle effectuée dans le cadre d'une chirurgie conservatrice d'exérèse pour tumeur du rein et pour lesquelles la stratégie chirurgicale impose quelquefois un clampage du pédicule rénal durant la procédure.

La vitamine C (Vit C) est un anti-oxydant naturel qui améliore la fonction rénale après transplantation [9]. La Vit C inhibe la péroxydation lipidique [10] et l'apoptose des cellules endothéliales [11], diminue la réponse inflammatoire [12], et augmente la production de NO par les cellules endothéliales [13].

Les divers traitements mis au point ne permettent pas un contrôle total des conséquences du syndrome d'I/R rénal. Il semble donc logique d'associer plusieurs attitudes thérapeutiques spécifiques afin de bénéficier d'un éventuel effet additif. Le but de notre travail a été de vérifier, d'une part, les effets du PCI et du pré-conditionnement pharmacologique induit par la Vit C et, d'autre part, de tester l'efficacité de l'association du PCI et de la Vit C sur la reprise fonctionnelle des reins après ischémie chaude prolongée dans un modèle murin.

MATERIELS ET METHODES

Choix des animaux

Des rats Wistar mâles pesant entre 160 et 230 g ont été utilisés dans ce travail expérimental. Tous les animaux ont eu un libre accès à l'eau et une nourriture standard.

Groupes expérimentaux

Nous avons utilisé 46 rats randomisés en 5 groupes expérimentaux (Figure 1) :

- Groupe sham (n=9) : les rats n'ont subi aucun traitement, seule la dissection du pédicule a été réalisée ;

- Groupe ischémie (n=10) : après dissection des pédicules rénaux, les deux reins ont subi une ischémie chaude pendant 60 min puis ont été reperfusés pendant 120 min ;

- Groupe pré-conditionnement ischémique (PCI, n=9) : après dissection des pédicules rénaux et juste avant l'ischémie chaude prolongée (60 min), les deux reins ont subi deux cycles successifs de 5 min ischémie chaude et 5 min reperfusion. Les reins ont été reperfusés pendant 120 min ;

- Groupe Vitamine C (Vit C, n=9) : après dissection des pédicules rénaux et 30 min avant le début de l'ischémie chaude prolongée (60 min), 100 mg de vitamine C/Kg de rat ont été administrés par la veine fémorale. Les reins ont été reperfusés pendant 120 min ;

- Groupe association des traitements vitamine C et pré-conditionnement ischémique (Vit C + PCI, n=9) : après pré-conditionnement pharmacologique (Vit C, 100mg/Kg) puis pré-conditionnement ischémique (PCI), les reins ont été clampés pendant 60 min. Les reins ont ensuite été reperfusés pendant 120 min.

Figure 1 : Groupes expérimentaux.

Protocole expérimental

Les rats ont été pesés, anesthésiés par injection intra péritonéale de kétamine (50 mg/Kg de poids), puis rasés sur toute la surface de l'abdomen, sur la face antérieure du cou et la cuisse gauche. L'abdomen a été préparé avec une solution iodée (Bétadine®).

Une incision médiane xypho-pubienne a permis d'exposer la cavité abdominale. Les pédicules rénaux ont été repérés puis disséqués (groupe contrôle) et clampés (groupe ischémie). Les différents traitements (Vit C ou/et PCI) ont été réalisés avant le clampage. Un sondage vésical a été effectué, dès le début de la période d'ischémie chaude, afin de collecter l'urine cumulée des reins. La paroi abdominale a été ensuite fermée (Dexon 5-0) et les rats ont été placés sur une table thermostatée de façon à maintenir leur température corporelle à 37°C.

A la fin de l'ischémie chaude (60 min), les clamps ont été enlevés et les reins ont été revascularisés. Puis, la paroi abdominale a été refermée une deuxième fois. La veine jugulaire a subi ensuite une dissection et un cathétérisme (Vénocath 16G) ; elle a été utilisée pour la perfusion (Minipuls 3, Gilson, France) des animaux avec une solution de mannitol (10%) et d'héparine (50 U/ml) chauffée. L'artère carotide a subi aussi une dissection et un cathétérisme (Vénocath 18G) ; elle a été utilisée pour suivre en continue la pression artérielle (Pressure Monitor BP-1, WPI, USA).

Quatre-vingt-dix minutes après le début de la reperfusion des reins, nous avons évalué le débit de filtration glomérulaire (DFG) pendant une période de 30 min. Des échantillons de sang et d'urine prélevés respectivement au niveau de l'artère carotide et de la sonde vésicale nous ont permis de mesurer les concentrations en créatinine, et de calculer la clairance de la créatinine dont la valeur est corrélée à la filtration glomérulaire. Nous avons aussi calculé le taux de réabsorption de sodium (TRNa) qui évalue la fonction tubulaire. Au terme de la procédure de la clairance rénale, du sang des animaux a été prélevé pour doser le lactate déshydrogénase (LDH). Les deux reins ont ensuite été néphrectomisés et le parenchyme a été utilisé pour doser le malondialdéhyde (MDA). Les rats ont été sacrifiés après la binéphrectomie.

Analyses biochimiques

Dosage du sodium

Les concentrations plasmatique et urinaire en Na ont été déterminées sur automate (Photomètre à flamme BT 634, Biotecnica instruments, Italie).

Dosage de la créatinine

Les concentrations plasmatique et urinaire en créatinine ont été dosées selon la réaction de Jaffé (Kit bioMérieux, France).

Dosage du lactate déshydrogénase

L'activité du LDH est mesurée selon la méthode de détermination cinétique (Kit bioMérieux, France).

Dosage du malondialdéhyde

Le MDA, en présence d'acide thiobarbiturique, donne une coloration rose qui est proportionnelle à sa quantité dans l'échantillon. Le MDA a été déterminé par la réaction de thiobarbiturate (MDA-tbar). En effet, 0.5 ml d'une solution d'acide trichloroacétique (20%) a été ajouté à 0.5 ml de l'homogénat rénal dans une solution tampon phosphate (0,067 M, pH 7,4). Après mélange et centrifugation, 0.5 ml d'une solution d'acide thiobarbiturique (0,67%) a été additionné au surnageant et l'ensemble a été mis en ébullition pendant 60 min. Après refroidissement du mélange dans de la glace, la densité optique a été lue à 530 nm.

Analyse statistique

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± l'erreur standard à la moyenne (± SEM). L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test ANOVA suivi par le test PLSD de Fisher. Une différence statistiquement significative est définie lorsque p<0,05.

Résultats

Le dosage du MDA-tbar tissulaire (Figure 2) nous permet d'évaluer la péroxydation lipidique. On observe qu'une ischémie prolongée induit une augmentation très significative du MDA-tbar par rapport au groupe contrôle (3,92 ± 0,39 vs 1,17 ± 0,08 nmol/mg de protéines, p<0,0001). Le PCI des reins et l'administration intraveineuse de la Vit C avant le clampage des pédicules rénaux entraïnent respectivement une diminution significative (p<0,05) de la concentration du MDA-tbar par rapport à celle du groupe ischémie (2,74 ± 0,31 et 3,14 ± 0,19 nmol/mg de protéines dans le groupe PCI et le groupe Vit C, respectivement). A l'opposé, l'association des deux traitements (groupe Vit C + PCI) n'a pas montré un effet bénéfique puisque les valeurs de MDA (3,56 ± 0,32 nmol/mg de protéines) sont statistiquement plus élevées (p<0,05) que dans le groupe PCI.

L'évaluation de l'activité du LDH plasmatique (Figure 3) nous renseigne sur l'état d'intégrité des membranes cellulaires. Après 60 min d'ischémie chaude, l'activité du LDH est significativement augmentée par rapport au groupe contrôle (633 ± 99 vs 251 ± 52 UI/L, p<0,05). Le prétraitement des reins avant l'ischémie par le PCI (389 ± 45 UI/L), la Vit C (387 ± 44 UI/L) ou par l'association de la Vit C et du PCI (350 ± 54 UI/L) diminuent l'activité du LDH par rapport au groupe ischémie (p<0,05).

La clairance de la créatinine (Figure 4) est un paramètre qui nous renseigne sur la filtration glomérulaire. L'ischémie chaude diminue fortement la clairance de la créatinine par rapport au groupe contrôle (33 ± 11 vs 387 ± 42 ¬µL/min/g de rein, p<0,0001). Cette filtration glomérulaire des reins ischémiques est multipliée par deux avec le PCI (77 ± 9 ¬µL/min/g de rein, p<0,05 vs groupe ischémie) et par quatre après l'injection intraveineuse de la Vit C (137 ± 24 ¬µL/min/g de rein, p<0,05 vs groupe ischémie). L'association des pré-conditionnements ischémique et pharmacologique (groupe Vit C + PCI) augmente la clairance de la créatinine par rapport à celle du groupe ischémie (87 ± 12 ¬µL/min/g de rein, p<0,05) mais reste significativement inférieure à celle du groupe Vit C (p<0,05).

Les résultats des taux de réabsorption de sodium, témoin des fonctions tubulaires, sont montrés dans la figure 5. On remarque que l'ischémie diminue significativement la fonction tubulaire par rapport au groupe contrôle (83,0 ± 5,3 vs 99,5 ± 0,2 %, p<0,05). Le taux de réabsorption de sodium est augmenté dans les groupes PCI (95,7 ± 0,4 %) et Vit C (94,5 ± 0,2 %) par rapport à celui du groupe ischémie (p<0,05 respectivement). Dans le groupe Vit C + PCI, il est à 91,9 ± 0,8 % ce qui est significativement plus bas que dans groupe Vit C seul ou dans le groupe PCI seul (p<0,05, respectivement).

Figures 2. Evaluation du malondialdéhyde tissulaire après 120 min de revascularisation des reins. Valeurs exprimées en Moyenne ± SEM. ** : p<0,0001 pour le groupe considéré vs sham ; # : p<0,05 pour le groupe considéré vs ischémie ; ý : p<0,05 pour le groupe considéré vs PCI.
Figure 3 : Dosage de la lactate déshydrogénase plasmatique après 120 min de reperfusion des reins. Valeurs exprimées en Moyenne ± SEM. * : p<0,05 pour le groupe considéré vs sham ; # : p<0,05 pour le groupe considéré vs ischémie.
Figure 4 : Etude de la clairance de la créatinine après 120 min de revascularisation des reins. Valeurs exprimées en Moyenne ± SEM. ** : p<0,0001 pour le groupe considéré vs sham ; # : p<0,05 pour le groupe considéré vs ischémie ; ý : p<0,05 pour le groupe considéré vs PCI ; + : p<0,05 pour le groupe considéré vs Vit C.
Figure 5 : Evaluation du taux de réabsorption du sodium après 120 min de reperfusion des reins. Valeurs exprimées en Moyenne ± SEM. * : p<0,05 pour le groupe considéré vs sham ; # : p<0,05 pour le groupe considéré vs ischémie.

Discussion

Les reins soumis à une ischémie chaude prolongée montrent une augmentation significative de la concentration tissulaire de MDA qui s'accompagne d'une augmentation également significative de LDH plasmatique et d'une diminution de la clairance de la créatinine, par comparaison au groupe sham. L'augmentation de l'activité du LDH dans le plasma est un des marqueurs de la perte de l'intégrité des membranes cellulaires après ischémie (nécrose). La reperfusion favorise une production massive de RLO. De tels métabolites sont libérés par les cellules endothéliales, les cellules glomérulaires, les cellules tubulaires et d'autres cellules inflammatoires. Les RLO, en agissant sur les cellules endothéliales des vaisseaux rénaux, entraïnent une expression des molécules d'adhésion membranaires. Il en résulte l'induction de réactions inflammatoires et la libération de chémokines et de cytokines qui recrutent d'autres cellules inflammatoires. Ceci peut entraïner l'obstruction des capillaires rénaux qui conduit à une diminution du débit sanguin rénal [14]. Au niveau des cellules tubulaires, les RLO provoquent la péroxydation des lipides des membranes cellulaires ce qui aboutit à une perte de l'intégrité membranaire et à la lyse cellulaire. Tous ces phénomènes affectent le fonctionnement glomérulaire et se traduisent par une réduction de la clairance de la créatinine.

L'ischémie rénale aboutit aussi à une diminution de la réabsorption sodique. Nous avons trouvé une diminution significative du TRNa dans le groupe ischémie par comparaison au groupe sham. Cette chute peut être une conséquence de la diminution de la clairance de la créatinine et des concentrations tissulaires en ATP. En effet, tout changement de la filtration glomérulaire entraïne un changement de réabsorption des solutés. De plus, le blocage de la pompe sodium consécutif à la déplétion en ATP et la redistribution des pompes Na/K ATPases liée à l'altération du cytosquelette réduisent le transport de Na à travers des cellules épithéliales [15].

De nombreuses études ont mis en évidence divers mécanismes protecteurs de la réponse cellulaire à l'I/R. L'utilisation du PCI augmente la tolérance de l'organe à une ischémie ultérieure prolongée. En ce qui concerne les reins, plusieurs cycles de PCI, dont le nombre et la durée sont très variables et avec des résultats contradictoires, sont décrits dans la littérature [6, 7, 16, 17]. Le PCI présente deux phases distinctes de protection : une précoce qui dure 2-3 h, et une autre tardive qui apparaît 12-24 h après l'induction du PCI et qui peut durer 3-4 j [18]. Dans notre travail, la reperfusion des reins dure 2 heures et les résultats concernent uniquement la phase précoce. Par comparaison au groupe ischémie, nous trouvons que le PCI des reins baisse les taux de MDA et de LDH et entraïne une amélioration significative du TRNa et de la clairance de la créatinine. Pendant la phase précoce de reperfusion, la résistance développée contre les lésions d'I/R résulte de la modulation de plusieurs facteurs cellulaires. En effet, le PCI est capable de réduire les catabolites cytotoxiques produits lors de l'ischémie, de prévenir l'acidose intracellulaire et de réduire le stress oxydant et la réponse inflammatoire [18].

La protection conférée par le PCI contre l'insuffisance rénale aiguë dans les modèles animaux semble reproductible. Fuller a montré que les greffons rénaux pré-conditionnés présentent un meilleur fonctionnement que ceux non traités [19]. Cependant, dans les conditions cliniques, l'effet du PCI sur le rein n'est pas encore bien élucidé [16, 17] même s'il est susceptible de prévenir le dysfonctionnement endothélial et l'activation des neutrophiles après une ischémie chaude de 20 min [20]. Clavien a montré que le PCI peut également protéger le foie humain contre les lésions d'I/R par inhibition de l'apoptose cellulaire et conservation du pool d'ATP [5]. L'efficacité du PCI dépend de plusieurs facteurs dont le temps d'ischémie et l'âge des patients, la protection semble d'autant plus marquée que les sujets sont jeunes.

L'administration intraveineuse de la Vit C avant la période d'ischémie induit une amélioration significative de la fonction rénale. Nos résultats montrent une augmentation significative de la clairance de la créatinine, et du taux de réabsorption sodique par comparaison au groupe d'ischémie. La Vit C s'oppose à l'initiation de la péroxydation lipidique par chélation ou par suppression de la production des RLO [10]. Cet effet est corrélé à une diminution significative de la concentration tissulaire en MDA. Enfin, par son activité anti-apoptique, la Vit C peut abolir l'apoptose des cellules endothéliales [11].

Les résultats du groupe Vit C + PCI montrent une légère amélioration des paramètres expérimentaux par rapport à ceux du groupe ischémie. Cependant, l'association des deux traitements n'améliore pas le fonctionnement des reins par rapport à une utilisation séparée du PCI ou de la Vit C. Les effets de la Vit C et du PCI ne sont donc pas additifs et il semble même que cette association puisse induire un antagonisme entre les deux traitements. On observe en effet une augmentation de la concentration de MDA tissulaire et une altération des capacités fonctionnelles des reins dans le groupe PCI + Vit C, par comparaison aux groupes Vit C et PCI pris séparément. Ces résultats suggèrent que la Vit C, par son pouvoir antioxydant, pourrait neutraliser certains RLO ce qui bloquerait l'effet protecteur du PCI et renforce les lésions d'I/R.

En conclusion, le PCI induit par deux cycles successifs de 5 min ischémie chaude et 5 min reperfusion et le pré-conditionnement pharmacologique par la Vit C améliorent l'activité fonctionnelle des reins exposés à une ischémie prolongée. Cependant, les effets protecteurs du PCI et de la Vit C ne sont pas synergiques et ne doivent à priori pas être associés. D'autres travaux dans des modèles animaux de plus grande taille sont nécessaires pour confirmer ces résultats et permettre l'utilisation du pré-conditionnement en pratique clinique.

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