Ischémie–reperfusion. Liquides de conservation et machines de perfusion en transplantation rénale

25 novembre 2016

Auteurs : B. Barrou, N. Chatauret, T. Hauet, R. Thuret, F. Kleinclauss, M.-O. Timsit, R. Codas, X. Matillon, L. Badet
Référence : Prog Urol, 2016, 15, 26, 964-976

Objectif

Décrire le mécanisme d’ischémie–reperfusion, ses conséquences sur le transplant rénal et les stratégies de conservation permettant de réduire les lésions d’ischémie–reperfusion.

Matériel et méthodes

Une recherche bibliographique exhaustive à partir de Medline (www.ncbi.nlm.nih.gov/) et Embase (www.embase.com/) a été réalisée en utilisant les mots clés suivants seuls ou en combinaison : « insuffisance rénale, transplantation rénale, lésions d’ischémie–reperfusion, préservation d’organe, machines de perfusion et cellules endothéliales ». Les articles obtenus ont ensuite été sélectionnés sur leur méthodologie, leur langue de publication (anglais/français), leur pertinence par rapport au sujet traité et leur date de publication. Seules les études prospectives et rétrospectives en anglais et en français, articles de revue, de méta-analyse ou de recommandations ont été sélectionnés (1293 articles). Après sélection en fonction du titre et du résumé et de la pertinence, 88 articles ont été analysés et inclus dans les différentes sous sections (ischémie–reperfusion 61 articles ; conservation d’organe 27 articles).

Résultats

Les lésions d’ischémie débutent lors du clampage de l’organe chez le donneur et perdurent jusqu’au déclampage. Les lésions de reperfusion correspondent à une aggravation des lésions précédentes lors de la phase initiale de reperfusion, conséquence de l’apport d’oxygène alors que le métabolisme mitochondrial n’est pas restauré, du réchauffement et de l’infiltration du greffon par les cellules du receveur. Outre d’importantes conséquences métaboliques et structurelles, ces lésions ont des conséquences immunologiques majeures, notamment par le biais de l’activation de l’immunité innée.

Conclusion

La compréhension des mécanismes d’ischémie–reperfusion est essentielle pour améliorer les techniques de préservation et limiter leur conséquence à long terme sur la survie des greffons et des patients. Parmi les stratégies pour lutter contre les lésions d’ischémie–reperfusion, la conservation des greffons sur machine à perfusion a montré son avantage tant sur la plan biologique que clinique. Les principes et les résultats de la perfusion des greffons seront décrits dans cet article.

   
 
 

 

 

Introduction

De tout temps, la transplantation s'est heurtée aux conséquences des lésions d'ischémie-reperfusion (IR), mais l'emploi actuel de greffons dits marginaux, provenant de donneurs décédés par mort encéphalique à critères étendus (DDME-ECD), ou de donneurs décédés par arrêt circulatoire (DDAC), pour faire face à la pénurie d'organes, les rendent encore plus critiques, nous obligeant à revisiter les concepts de préservation d'organes. Les lésions d'IR ont beaucoup été étudiées sur des modèles animaux (notamment le rat) et pour différents organes. Même s'il existe des spécificités d'organes, nombreux sont les mécanismes communs, extrapolables d'un organe à un autre, ce qui explique que les études citées ne concernent pas toutes le rein. Les différents modes de conservations (statique, machine à perfusion) comme les différents liquides de conservation des organes ont aussi un impact sur la survie des greffons.

 

Matériel et méthodes

Une recherche bibliographique exhaustive à partir de Medline (www.ncbi.nlm.nih.gov/) et Embase (www.embase.com/) a été réalisée en utilisant les mots clés suivants seuls ou en combinaison : « insuffisance rénale, transplantation rénale, lésions d'ischémie-reperfusion, préservation d'organe, machines de perfusion, cellules endothéliales ». Les articles obtenus ont ensuite été sélectionnés sur leur méthodologie, leur langue de publication (anglais/français), leur pertinence par rapport au sujet traité et leur date de publication. Seules les études prospectives et rétrospectives en anglais et en français, articles de revue, de méta-analyse ou de recommandations ont été sélectionnés (1293 articles). Après sélection en fonction du titre et du résumé et de la pertinence, 88 articles ont été analysés et inclus dans les différentes sous sections (ischémie-reperfusion 61 articles ; conservation d'organe 27 articles).

 

Résultats

 

Ischémie-reperfusion

Les lésions d'ischémie débutent lors du clampage de l'organe chez le donneur et perdurent jusqu'au déclampage. Le terme d'ischémie est réducteur, car les lésions débutent en fait dès le passage en mort encéphalique (qui déclenche un véritable « orage cytokinique » dont la conséquence est l'induction en quelques heures d'un état inflammatoire des organes en périphérie). Les lésions de reperfusion correspondent à une aggravation des lésions précédentes lors de la phase initiale de reperfusion, conséquence de l'apport d'oxygène alors que le métabolisme mitochondrial n'est pas restauré, du réchauffement et de l'infiltration du greffon par les cellules notamment mononuclées du receveur. Ces lésions ont été très étudiées dans les années 1980, permettant la mise au point de solutions de préservation d'organes adaptées à la transplantation. Puis, elles sont passées au second plan, au profit de l'immunologie de transplantation, qui a occupé le devant de la scène ces trente dernières années. Pourtant, la préservation d'organes est une phase critique en transplantation. On peut la comparer aux fondations d'un édifice, qui sont invisibles mais qui conditionnent grandement sa stabilité et sa solidité. On sait maintenant que les lésions d'IR ont des conséquences sur la survie à long terme du greffon [1

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La compréhension de ces lésions est déterminante pour élaborer de nouvelles méthodes de préservation, adaptées à la qualité des greffons actuels et susceptibles de prévenir la superposition de lésions aiguës peut-être réversibles aux lésions chroniques, elles irréversibles, dues au profil des donneurs actuels.

 
Les lésions débutent dès la survenue de la mort encéphalique chez le donneur

Les lésions que vont subir les organes au cours des processus de prélèvement et de transplantation débutent dès la survenue de la mort encéphalique chez le donneur. Les phénomènes induits par la mort encéphalique ont été caractérisés sur des modèles animaux dans les années 1980-1990 : libération de cytokines pro-inflammatoires, activation des cellules endothéliales, surexpression des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II et infiltration des organes périphériques par des cellules inflammatoires [3

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. L'activation des cellules endothéliales est très précoce (dès la 30e minute). Les mRNA des P-sélectines et E-sélectines apparaissent dans les mêmes délais et augmentent proportionnellement avec la durée de la mort encéphalique. Les marqueurs de souffrance tubulaire (urine heart-fatty-acid-binding-protein et nacetyl-glucosaminidase ) apparaissent également précocement et continuent d'augmenter jusqu'à la 4e heure [5

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Enfin, il a été montré que la mort encéphalique entraînait une activation du complément ainsi que le production de facteur pro-coagulants [6

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Tous ces phénomènes concourent à créer un contexte inflammatoire qui aggravent les lésions d'ischémie-reperfusion [7

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Elles concourent également à augmenter l'immunogénicité du greffon, qui est alors plus fortement reconnu par le système immunitaire du receveur. En pratique clinique, il a été montré que les greffons prélevés chez des donneurs décédés par mort encéphalique présentaient un taux de rejet aigu ou chronique supérieur à des greffons de donneurs vivants à degrés d'histo-incompatibilité comparables [8

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Conséquences métaboliques des lésions d'IR au niveau cellulaire

L'ischémie s'accompagne d'une privation en nutriments et en oxygène et d'une accumulation de déchets du métabolisme cellulaire, devenu alors anaérobique. La tolérance à l'ischémie à 37°C est variable d'un organe à l'autre, allant de quelques minutes pour le cerveau à 30minutes pour le rein [12

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Des durées plus longues d'ischémie entraînent invariablement des perturbations importantes du métabolisme cellulaire qui résultent en des lésions irréversibles plus ou moins sévères.

 
Une chaîne respiratoire en petite forme...

La première conséquence de l'ischémie est la privation en O2 , substrat de la chaîne respiratoire, permettant à l'état physiologique la production d'ATP à partir d'une tétra-réduction de l'oxygène.

La seconde conséquence est l'arrêt de la phosphorylation oxydative du glucose, qui, à l'état physiologique, est transformé en pyruvate puis en Acetyl-CoA alimentant alors le cycle de Krebs : une mole de glucose permet, dans ces conditions, de produire 38 moles d'ATP. En l'absence d'O2 , le bilan est nettement moins brillant puisque que la glycolyse anaérobie ne permet d'obtenir à partir d'une mole de glucose que 2 moles d'ATP, et 2 moles d'acide lactique, à l'origine d'une acidose [13

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Au sein de la chaîne respiratoire, les réductions sont successives : bien qu'acceptant toujours au total quatre électrons pour former H2 O, l'oxygène sera réduit par étapes monovalentes, produisant ainsi trois types d'intermédiaires réactifs, le radical superoxyde, O2−, le peroxyde d'hydrogène H2 O2 et le radical hydroxyle OH•âˆ’. À l'état physiologique, il existe donc une production de radicaux libres, mais elle est modérée et il existe des systèmes antioxydants naturels enzymatiques (superoxyde dismutases [SOD], catalases et peroxydases) et non enzymatiques (vitamines C et E, glutathion réduit). En situation pathologique et notamment au cours de l'ischémie, ceux-ci sont débordés par un flux d'espèces oxydantes trop important. Ces espèces radicalaires vont alors soit indirectement favoriser, soit directement initier des réactions en chaîne dont la première étape est souvent la rupture homolytique des liaisons carbone-hydrogène ou l'addition sur les doubles liaisons carbone-carbone, des biomolécules constituant le « squelette » de la cellule (phospholipides, protéines et acides nucléiques) [14

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Une production insuffisante d'ATP...

Ce métabolisme anaérobique produit une quantité insuffisante d'ATP pour répondre aux besoins cellulaires, et le manque d'oxygène va encore aggraver la pénurie en ATP, en induisant l'inversion d'activité de la F1F0-ATP synthase, qui va hydrolyser l'ATP au lieu de le synthétiser, de manière à maintenir la différence de potentiel membranaire de la mitochondrie, compromis par l'inhibition du transfert d'électrons de la chaîne respiratoire [15

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La baisse conjointe des réserves en ATP et du pH intracellulaire va entraîner une instabilité lysosomale, libérant des hydrolases, qui vont provoquer des lésions des structures de la cellule [16

Cliquez ici pour aller à la section Références], et inhiber les pompes ioniques, notamment les pompes Na-K qui sont ATP dépendantes [17

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. Il en résulte une entrée massive de Na+ dans la cellule, suivie d'eau, à l'origine d'un Å“dème intracellulaire [13

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L'augmentation du Na+ intracellulaire entraîne l'accumulation de Ca++ qui n'est plus transporté hors de la cellule. La concentration de Ca++ est encore augmentée par l'arrêt de la captation par le réticulum endoplasmique en raison du manque d'ATP [19

Cliquez ici pour aller à la section Références]. L'augmentation de la concentration intracellulaire de Ca++ entraîne l'activation des protéases Ca-dépendantes, comme les calpaïnes, transitoirement inhibées par l'acidose, mais qui vont s'activer lors de la correction du pH à la phase de reperfusion [20

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Production d'espèces radicalaires oxygénées

L'augmentation de la concentration intracellulaire de Ca++ entraîne également une augmentation de sa concentration intramitochondriale, à l'origine d'une ouverture du pore de transition mitochondrial, ouverture limitée dans un premier temps par l'acidose mais qui va survenir de façon retardée au déclampage lors de la normalisation du pH, entraînant la mort cellulaire par apoptose [22

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Pendant la période d'ischémie, de relativement petites quantités d'espèces radicalaires oxygénées sont produites. Les sources en sont :

la réduction des cytochromes leur permettant de transférer directement les électrons sur les molécules d'O2 [23] ;
le découplage de la NO synthase qui, normalement réduit l'arginine pour produire du NO en présence de tetrahydrobiopterine et d'O2 [24] ;
l'activation de la xanthine oxydase et de la NADPH oxydase [25].

Le stress oxydant est encore aggravé par l'inhibition, en hypoxie, de l'activité des agents anti-oxydants comme la superoxyde dismutase, la catalase et la gluthation permutase [25

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L'anion superoxide (O2−) va réagir avec le NO pour former le peroxynitrite (ONOO−), un puissant oxydant capable de modifier la structure des protéines de conformation par nitrotyrosilation. Enfin, l'hypoxie inhibe l'expression d'une sous-unité du complexe intraveineuse, l'accepteur final d'électron au sein de la chaîne respiratoire. Malgré toutes ces sources de radicaux libres, les pertes cellulaires sont relativement limitées pendant la phase d'ischémie (4 et 17 % des cardiomyocytes après 1 et 4heures d'ischémie) [27

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Lors de la reperfusion, les choses s'aggravent paradoxalement...

Cette aggravation est attestée par un taux de mort cellulaire beaucoup plus élevé : 73 % des cardiomyocytes après reperfusion [27

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Le paradoxe du pH : la correction de l'hypoxie intervient rapidement et la correction du pH extracellulaire est précoce. Ces phénomènes paradoxalement sont délétères pour les cellules en ischémie car ils créent un gradient H+ au niveau de la membrane plasmatique qui provoque un afflux massif de Na+ (donc d'eau) dans le secteur intracellulaire [19

Cliquez ici pour aller à la section Références], qui à son tour aggrave la surcharge calcique cytoplasmique et mitochondriale à l'origine d'une ouverture du pore de transition mitochondrial qui n'est plus freinée par l'acidose en partie corrigée, et d'une activation des calpaïnes. Celles-ci hydrolysent les protéines de structure conduisant à la mort cellulaire.

La reperfusion s'accompagne également d'une production massive de radicaux libres par plusieurs mécanismes :

levée de l'inhibition par l'ATP du complexe intraveineuse de la chaîne respiratoire [28] ;
réduction des moyens physiologiques de défense contre les radicaux libres (comme la superoxyde dismutase) [25, 26]. Ces derniers vont altérer des composants essentiels de la cellule comme les lipides membranaires et l'ADN. Ils vont également, en association avec l'élévation de la concentration intramitochondriale de Ca++, entraîner l'ouverture du pore de transition membranaire de la mitochondrie [12]. Cette ouverture provoque une entrée d'eau et de solutés dans la mitochondrie, ce qui entraîne une rupture de la membrane externe de la mitochondrie [21] et un relargage de cytochrome C dans le cytosol, où il active la caspase 3 pro-apoptotique [13]. Ces phénomènes conduisent rapidement à la mort cellulaire par différents mécanismes indépendants, parfois associés, l'apoptose, la nécrose et l'autophagie. L'apoptose (ou mort cellulaire programmée) nécessite de l'ATP et aboutit à une destruction cellulaire complète sans inflammation. La nécrose cellulaire entraîne une rupture de la membrane cellulaire et une libération du contenu cytosolique à l'origine d'une inflammation [21]. L'autophagie est un phénomène d'élimination des agrégats de matériel intracellulaire et d'organelles, qui produit des substrats riches en énergie dans un contexte d'apports limités de nutriments [29, 30]. L'incidence de l'apoptose est inférieure à celle de la nécrose [12], et l'orientation vers l'une ou l'autre semble dépendre du niveau de réserve énergétique de la cellule au moment de la reperfusion [31].

 
L'hypothermie permet de limiter les dégâts, mais n'est pas sans conséquences...

Les lésions d'ischémie-reperfusion sont tellement sévères qu'aucun organe ne peut supporter en ischémie chaude les délais imposés en transplantation. La seule solution pour les limiter est de mettre les organes en hypothermie à 4°C, c'est-à-dire appliquer à la transplantation la loi du chimiste néerlandais Jacobus Henricus van't Hoff (premier prix Nobel de chimie en 1901), qui stipule que la baisse de la température de 10°C réduit l'activité enzymatique de moitié. Le métabolisme cellulaire est réduit 12 à 13 fois entre 37 et 0°C et par conséquent la demande en oxygène et nutriments [32

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Toutefois à 4°C, il persiste 10 à 12 % du métabolisme, ce qui signifie que les organes continuent à subir les processus lésionnels de l'ischémie. Par ailleurs, l'hypothermie en elle-même a des effets délétères sur le métabolisme cellulaire. Elle peut induire des déséquilibres de l'homéostasie avec, par exemple, afflux de CA++ intracellulaire, Å“dème intra- et extra-cellulaire [32

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. Il a été montré que le refroidissement suivi de réchauffement d'hépatocytes pouvaient entraîner leur apoptose [35

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Un des enjeux actuels en préservation d'organes est de poursuivre le recours à l'hypothermie tout en essayant de limiter ses effets secondaires.

 
Les lésions d'ischémie-reperfusion au niveau des cellules endothéliales

L'étude des lésions d'ischémie-reperfusion au niveau des cellules endothéliales est particulièrement importante, d'une part car la barrière endothéliale représente physiquement le premier lieu de « rencontre » entre donneur et receveur, d'autre part parce que la microvascularisation est particulièrement sensible à ces lésions. Les conséquences lors de la reperfusion peuvent être observées macroscopiquement, lorsque la reperfusion du rein est inhomogène (phénomène de no reflow ), traduisant une obstruction des microvaisseaux du fait de l'Å“dème des cellules endothéliales, et de l'obstruction des lumières par des leucocytes, de la fibrine et des plaquettes.

La disparition de tout flux au niveau de la surface des cellules endothéliales a des conséquences néfastes importantes. Une culture primaire de cellules endothéliales n'est possible que si les cellules sont soumises à un flux laminaire, qui est enregistré au niveau de mécanorécepteurs, présents à la surface des cellules. Le message mécanique est transmis en message biochimique, qui concourt à la survie des cellules par synthèse de facteurs antithrombotiques, antimigratoires comme le monoxyde d'azote (NO), la prostacycline (PIG2), la thromboplastine (tPA) et au contraire, inhibition de facteurs de croissance des cellules musculaires lisses (NO et TGFß). À l'inverse, si les cellules ne sont soumises à aucun flux, elles entrent en apoptose avec synthèse de facteurs favorisant la migration trans-endothéliale (MCP-1, VCAM-1), ainsi que la prolifération des cellules musculaires lisses (angiotensine II, PDGF, endothéline) [36

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Il a également été montré que la disparition du flux et du « shear stress » engendré entraîne l'arrêt de la sécrétion d'un facteur vasoprotecteur, le KLF-2 (Kruppel like Factor 2), dont la fonction est de prévenir la synthèse d'endothéline et de vascular cell adhesion molecule (VCAM-1), induites par IL-1b [37

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. L'interruption du flux entraîne donc des modifications endothéliales qui vont favoriser l'adhésion des cellules du receveur et leur transmigration à travers la barrière endothéliale, qui joue ainsi de moins en moins ce rôle de barrière, permettant l'infiltration massive du greffon par les cellules du receveur qui vont participer à l'aggravation des lésions d'ischémie-reperfusion par une production massive de radicaux libres, et la sécrétion de chimiokines, qui vont à leur tour favoriser la transmigration des cellules du receveur. Un véritable cercle vicieux s'est installé [39

Cliquez ici pour aller à la section Références]. C'est probablement par l'un de ces mécanismes que les machines de perfusion exercent leur effet bénéfique sur la préservation rénale. Nous avons pu montré que les reins préservés sur machine de perfusion présentaient une moindre infiltration par les cellules T-CD3+, les monocytes et les macrophages du receveur, par rapport aux reins préservés de manière statique [14

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Conséquences des lésions d'IR au niveau des cellules tubulaires épithéliales

L'effet de l'ischémie et notamment de la disparition de tout flux est moins bien connu pour les cellules tubulaires épithéliales, en partie du fait de la difficulté de mener des travaux à ce niveau. Il a été montré que l'exposition des cellules d'une lignée tubulaire épithéliale (HK-2) à un flux laminaire (shear stress ) entraîne une augmentation de la production de mRNA de KLF2, une réduction de la synthèse de mRNA des molécules d'adhésion et des cytokines inflammatoires (comme ICAM-1, VCAM-1, et IL-8), mais aussi de KIM-1, un marqueur de souffrance tubulaire [43

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L'ischémie a aussi des conséquences immunologiques...

Les lésions d'IR sont un puissant activateur de l'immunité innée, qui représente une première ligne de défense rapidement mobilisable, contre les agressions que peut subir un organisme [44

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Elle est constituée de nombreuses cellules comme les polynucléaires neutrophiles, les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages, qui, toutes, expriment des récepteurs appartenant à la famille hétérogène des pattern recognition receptors (PRR) [45

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Il est à noter que les cellules endothéliales [46

Cliquez ici pour aller à la section Références] ou épithéliales [47

Cliquez ici pour aller à la section Références] qui jouent un rôle de premier plan en préservation d'organes, expriment aussi ces récepteurs.

Cette famille de récepteurs est capable de reconnaître 2 types de ligands, ceux générés par de nombreux agents infectieux, les pathogen associated molecule patterns faisant de l'immunité innée une première ligne de défense contre les agents infectieux, mais aussi des ligands endogènes produits dans différentes situations d'agression cellulaire et tissulaire et en particulier l'ischémie-reperfusion, les danger associated molecule patterns (DAMPS). De nombreux DAMPS ont été identifiées : high mobility Group Box-1 (HMGB-1), heparan sulfate, ATP, ADN nucléaire, ADN et ARN mitochondrial.

L'activation des PRR entraîne la production de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires comme IL-1, IL-6, TNF-a, monocyte chemoattractant protein (MCP-1), IL-8 [48

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. Elle entraîne également une augmentation de l'expression membranaire des molécules accessoires d'activation des lymphocytes-T et des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, 2 conditions qui résultent en une augmentation de l'immunogénicité du greffon [50

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Parmi les récepteurs capables de reconnaître les DAMPS, les toll-like receptors (TLR) 2 et 4 ont une place importante. Il a été montré que les souris déficientes en TLR-2 et 4 sont protégées et développent des lésions d'ischémie-reperfusion moins sévères [51

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. À l'opposé, les agonistes des TLR augmentent le rejet d'une allogreffe cardiaque [53

Cliquez ici pour aller à la section Références], et il a été montré sur différents modèles expérimentaux que l'allo-immunité était majorée par l'activation de la cascade de l'immunité innée, aboutissant à l'activation des cellules dendritiques qui fournissent alors le second signal d'activation via les molécules accessoires d'activation, cette costimulation étant indispensable à l'activation d'un lymphocyte T-naïf en réponse à un alloantigène [54

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Ces liens entre l'activation de l'immunité innée et l'allo-immunité sont désormais assez bien établis pour que l'on apporte la plus grande vigilance aux conditions de préservation d'organe, dont on n'a eu pendant trop longtemps qu'une lecture métabolique. Ainsi, plusieurs équipes se sont intéressées au rôle des molécules de polyéthylène glycol (PEG) dans les solutions de conservation de 4e génération [58

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Cliquez ici pour aller à la section Références]. Selon certains auteurs, les molécules de PEG, en structurant les molécules d'eau avoisinantes, réaliseraient une sorte de brouillard à la surface des cellules, permettant un immunomasquage antigénique temporaire, mais réalisé au moment de la phase critique de la reperfusion, c'est-à-dire pendant la phase maximale d'activation de l'immunité innée [60

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Ce principe d'immunomasquage a été validé sur un modèle préclinique d'allogreffe rénale chez le porc avec une prolongation de la survie d'allogreffe par la seule solution de préservation utilisée, les receveurs ne recevant aucun traitement immunosuppresseur [41

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Toutefois, il n'est pas prouvé que cet effet immunoprotecteur soit du uniquement à un phénomène d'immunomasquage [61

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Conclusion

Les lésions d'ischémie-reperfusion sont complexes mais leur connaissance progresse et laisse entrevoir des modifications importantes dans le domaine de la préservation d'organes. Le recours de plus en plus fréquent à la perfusion des organes ouvrent des possibilités d'intervention soit diagnostiques, soit thérapeutiques ex vivo pendant la phase de préservation. On peut ainsi imaginer, dans un futur proche, disposer d'arguments objectifs pour accepter ou refuser un greffon et disposer d'outils thérapeutiques permettant de limiter ou prévenir les lésions d'ischémie-reperfusion.

 

Liquides de conservation et utilisation des machines de perfusion en transplantation rénale

Les lésions d'IR touchent tous les organes prélevés, mais l'emploi actuel de greffons dits marginaux provenant de donneurs à critères étendus (DCE) pour faire face à la pénurie d'organes, les rend encore plus sensibles à l'ischémie, nous obligeant à revisiter les concepts de préservation d'organes. Différentes modalités de conservation sont aujourd'hui accessibles.

 
La préservation statique

La préservation statique (PS) à 4 ÌŠC, utilisant le lavage et l'immersion du rein dans une solution de conservation a été pendant longtemps la méthode de référence du fait de sa simplicité et des résultats acceptables avec des greffons de bonne qualité. Cette méthode de conservation qui reste actuellement la plus utilisée s'accompagne d'un rinçage de l'organe prélevé avec une solution électrolytique tamponnée refroidie à+4°C, suivi d'une conservation dans une solution souvent de même nature jusqu'au moment de la transplantation. Un article de synthèse sur les liquides de perfusion a été publié il y a une dizaine d'année [59

Cliquez ici pour aller à la section Références] et les choses ont assez peu changées depuis.

In fine, le rôle du liquide de conservation va être de diminuer la survenue de :

l'Å“dème cellulaire ;
l'acidose cellulaire ;
la destruction des membranes cellulaires ;
les altérations mitochondriales ;
la formation de radicaux libres.

Les liquides permettent par ailleurs :

d'assurer un lavage complet du sang du greffon ;
et de distribuer de façon homogène l'hypothermie.

Les principales solutions utilisées peuvent être séparées en trois groupes (Tableau 1) :

les solutions à K+ supérieur à 30mM (appelées intracellulaires) ;
les solutions à K+ inférieur à 5,5mM (appelées extracellulaires) ;
les solutions à K+ entre 6 et 30mM (appelées intermédiaires).

Les solutions riches en potassium dites hyperpotassiques ou intracellulaires entraînent une dépolarisation cellulaire, qui induit une vasoconstriction, une augmentation des pressions de perfusion et une diminution du débit pendant la reperfusion. Un second effet d'une forte concentration de potassium est la perte du gradient de concentration potassique de part et d'autre de la membrane qui va entraîner une accélération du fonctionnement des pompes ioniques conduisant à une dégradation de l'ATP et à une acidose du fait de la production de protons H+.

La présence dans le milieu extracellulaire de molécules exerçant une pression oncotique permettant d'éviter l'Å“dème est indispensable pour optimiser la qualité d'un liquide de conservation.

Il est classique de diviser les molécules limitant l'Å“dème en deux familles :

les imperméants qui sont :
∘
soit des sucres (raffinose, sucrose, mannitol, glucose...) qui limitent, par la pression osmotique qu'ils exercent dans le compartiment vasculaire, la formation de l'Å“dème intracellulaire,
∘
soit des anions tels que le citrate, le gluconate ou l'acide lactobionique qui présentent par ailleurs un effet protecteur de membrane ;
les colloïdes (hydroxye-éthyl amidon, polyéthylèneglycol, albumine, dextran...) qui ne peuvent pas passer la membrane cellulaire et qui préviennent par la pression oncotique qu'ils exercent, la constitution d'un Å“dème interstitiel. Leur utilisation semble bénéfique en particulier pour des temps d'ischémie longs. Les PEG bénéficient d'une mention particulière pour leur effet d'immunomasquage qui pourrait avoir un effet immunoprotecteur (démontré expérimentalement) [41, 62] vis-à-vis du déclenchement de la réaction alloimmune.

Le fait que les solutions de conservation doivent au moins être pourvues d'un imperméant et ou d'un colloïde est acquis. L'hydrolyse de l'ATP qui est la principale source de protons est responsable de l'acidose. La production anaérobie de lactate permet de compenser partiellement l'acidose en stabilisant le pH. L'utilisation d'un tampon est donc indispensable pour amortir les variations du pH du compartiment intravasculaire, interstitiel et cellulaire. Les principaux tampons utilisés restent les tampons bicarbonate, phosphate, histidine, HEPES et tryptophane. Par contre, il n'est pas acquis que l'utilisation de substance antioxydantes telles que le glutathion, le lactobionate et d'autres molécules soit indispensable. L'UW qui a bénéficié d'une étude randomisée [63

Cliquez ici pour aller à la section Références] dans les années 1990, est longtemps resté la solution de référence mais de nombreuses raisons d'ordre métaboliques et physiologique font que le concept même de l'utilisation des solutions intracellulaires est remis en question.

Même si nous ne disposons aujourd'hui d'aucune étude randomisée de puissance suffisante, les études pré-cliniques plaident plutôt aujourd'hui pour l'utilisation de solutions modernes non intracellulaires bien tamponées et utilisant un colloïde ou un imperméant actif [64

Cliquez ici pour aller à la section Références]. À ce titre, les solutions de quatrième génération utilisant une solution extracellulaire ou intermédiaire et un PEG doivent être considérées comme les solutions probablement les mieux adaptées [41

Cliquez ici pour aller à la section Références].

L'UW ou ses équivalents semblent garder une supériorité dans les résultats cliniques sur les solutions hybrides et plus particulièrement sur HTK lorsque les temps d'ischémies des reins sont prolongés ou dans les groupes à risque [65

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Ceci est également vrai pour les transplantations pancréatiques [66

Cliquez ici pour aller à la section Références] et hépatiques [67

Cliquez ici pour aller à la section Références]. HTK donne cependant des résultats équivalents pour des temps d'ischémie courts [68

Cliquez ici pour aller à la section Références, 69

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Le Celsior semble donner des résultats équivalents à l'UW [70

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Seul le Celsior peut aujourd'hui être utilisé à l'étage thoracique et à l'étage abdominal mais le rationnel de l'utilisation d'une solution de conservation unique aux deux étages pour des organes ayant des problématiques métaboliques et de conservation très différentes reste une question débattue en dehors du côté pratique [71

Cliquez ici pour aller à la section Références, 72

Cliquez ici pour aller à la section Références].

Il n'est pas simple de savoir quelle quantité de liquide de conservation utiliser lors du prélèvement puisque chaque laboratoire donne des consignes variables quant au volume de liquide à utiliser. L'expérience montre qu'il est exceptionnel de n'utiliser que deux litres de Belzer (quantité recommandée) durant un prélèvement multi-organe et qu'on est très souvent plus proche des 4 ou 5 litres. Il faut probablement considérer que, lorsque le liquide de lavage est clair dans la canule de décharge cave, la quantité de liquide passée est suffisante et que le prélèvement des organes à proprement parler peut avoir lieu.

Différentes étapes donnent l'opportunité d'utiliser différents types de solutions : la perfusion de l'organe durant le prélèvement, la préparation de l'organe avant son conditionnement, la conservation hypothermique et la préparation de l'organe avant la greffe. L'idéal n'est pas forcement d'utiliser une seule solution de conservation pour toutes ces étapes puisque, lorsqu'une solution riche en potassium est utilisée, il est recommandé de rincer l'organe avant la greffe avec une solution extracellulaire ou intermédiaire. Ce rinçage a l'intérêt d'éliminer le potassium qui expose à des troubles du rythme cardiaque lors du relargage de quantités importantes de potassium ; mais également de rincer l'organe de tous les produits de dégradation du métabolisme cellulaire qui se sont accumulés durant la période de conservation et qui vont participer à la mise en jeu de la cascade événementielle conduisant aux lésions de reperfusion. Enfin, l'utilisation pour le rinçage d'une solution extracellulaire à haute concertation en PEG pourrait avoir un effet bénéfique sur la réponse immune mais cet effet reste à démontrer en pratique clinique.

Lorsqu'une solution de type extracellulaire ou intermédiaire a été choisie pour le prélèvement, il est cohérent d'utiliser la même solution pour la période de préservation, et pour le rinçage cela permet de limiter la vasoconstriction de la microvascularisation.

Les blocs opératoires ne pouvant souvent pas disposer du panel complet des solutions utilisées en France, il est conseillé que chaque bloc ait en réserve quelques litres de liquides de type extracellulaires ou intermédiaire et que pour les liquides en cours d'évaluation clinique, un litre de produit soit acheminé avec l'organe du centre de prélèvement au centre de greffe. Certaines équipes rincent avec du sérum physiologique ou du ringer lactate , ce qui ne peut être recommandé dans la mesure où ces liquides induisent un Å“dème cellulaire.

Si le froid augmente la tolérance à l'ischémie en diminuant les besoins énergétiques et certaines activités enzymatiques, les activités métaboliques persistant en anoxie et conduisent à la production de déchets toxiques pour la cellule. Selon la loi de Van't hoff, l'activité enzymatique est d'environ 12 % du métabolisme cellulaire à 4°C, ce qui fait que l'organe continu à se dégrader. C'est la raison pour laquelle la préservation dynamique du greffon rénal par machine de perfusion (PMP) est particulièrement intéressante.

 
Les machines de perfusion

Le concept date de 1933 [72

Cliquez ici pour aller à la section Références], et les premières machines ont été utilisées dans les années 1970-1980 [73

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Mais la complexité de mise en Å“uvre et l'absence de preuves formelles d'efficacité face à des temps d'ischémie assez courts n'ont pas permis de convaincre les transplanteurs, ce qui fait que la perfusion rénale est restée confidentielle jusque dans les années 2000.

Les données du problème ont maintenant radicalement changé puisque :

les progrès technologiques ont permis de réduire la taille des machines et de simplifier leur utilisation ;
l'intérêt de la PMP est désormais établie de façon formelle pour les greffons de donneurs à critères étendus (>60ans ou>50ans avec deux des trois facteurs de risque suivants : décès par accident vasculaire cérébral [AVC], hypertension artérielle [HTA], créatininémie>132μmol/L) et ceux décédés après arrêt cardiaque. Les premiers parce qu'ils sont le siège de lésions chroniques secondaires aux comorbidités du donneur, les seconds parce qu'ils ont souffert d'ischémie chaude pendant l'arrêt cardiaque. La perfusion permet de réduire le taux de non-fonction primaire, de reprise retardée de fonction (RRF), classiquement défini par la nécessité de recourir à au moins une séance d'hémodialyse au cours de la première semaine postopératoire, le nombre de séances de dialyse en cas de RRF.

Le principal essai randomisé disponible comparant des paires de reins dont l'un est perfusé et l'autre placé en incubation statique a démontré une amélioration significative de 4 % de la survie du greffon rénal à un et trois ans sans stratification des groupes de donneurs [74

Cliquez ici pour aller à la section Références, 75

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Ce résultat représente une avancée importante car dans les traitements modernes de la transplantation, rien ne permet d'espérer des gains de survie de cette nature. C'est dire l'importance des conditions de la préservation des organes avant transplantation. Les données de ce travail ont été stratifiées et il apparaît que l'utilisation de la machine de perfusion est d'autant plus utile qu'il s'agit de donneurs à risque, c'est-à-dire à critère étendus ou DDAC [75

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Une étude complémentaire de 91 paires de reins issus de DCE montre une amélioration de survie des greffons de 8 % à 1 an [76

Cliquez ici pour aller à la section Références] avec un effet particulièrement bénéfique dans le groupe des reins présentant une reprise retardée de fonction. Dans le cadre du programme « old for old » d'Eurotransplant [77

Cliquez ici pour aller à la section Références], le taux de non-fonction primaire a été réduit dans le groupe de greffons perfusés (de 12,9 à 3,5 %) et la survie des greffons à 1 an améliorée en cas de survenue d'une RRF (de 48 à 84 %). Concernant les DDAC la perfusion sur machine a permis de réduire l'incidence de RRF de 69,5 à 53,7 %, de raccourcir de 4jours la période de dépendance envers la dialyse et d'augmenter la clairance de la créatinine à 1 mois [78

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Concernant spécifiquement les reins issus de donneurs décédés par arrêt cardiaque, le cadre réglementaire du protocole national Français a rendu obligatoire l'utilisation de la machine de perfusion comme méthode de préservation rénale avant la transplantation en se fondant sur les expériences cliniques de plusieurs centres internationaux qui montraient bien que l'utilisation de la machine de perfusion permettait d'améliorer significativement les survies de greffons et de limiter le risque de non-fonction primaire des greffons rénaux [79

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Une méta-analyse récente à partir des principaux essais plaide par ailleurs pour un effet bénéfique de la machine sur la survie et la fonction de greffons [80

Cliquez ici pour aller à la section Références].

Les mécanismes d'action de la PMP sont encore incomplètement compris. Ils sont probablement multifactoriels [42

Cliquez ici pour aller à la section Références]. On peut retenir les mécanismes suivants :

pendant la phase de préservation :
∘
fonction de lavage : élimination des déchets toxiques produits par le métabolisme anaérobie,
∘
apport d'oxygène permettant d'assurer le métabolisme résiduel (mais cela dépendra du type de machine utilisée),
∘
maintien de l'intégrité et de la fonction des cellules endothéliales,
∘
modification de l'expression de certaines molécules de surface,
∘
préparation à la revascularisation par une ouverture du lit vasculaire avant la greffe ;
après revascularisation de l'organe :
∘
diminution de l'infiltration cellulaire du greffon,
∘
diminution de la transition épithélio-mesenchymateuse,
∘
diminution de la fibrose.

Le mécanisme le plus important est vraisemblablement une meilleure protection de la barrière endothéliale qui reste le lieu des premiers échanges entre donneur (l'endothélium) et receveur (le sang). En effet, le phénotype des cellules endothéliales dépend des contraintes mécaniques qui s'appliquent à leur surface. Schématiquement, quand ces contraintes sont nulles (pas de flux), le programme cellulaire s'oriente vers l'apoptose, la morphologie des cellules endothéliales se modifie et favorise la diapédèse des cellules immunocompétentes et l'infiltration sous endothéliale par les leucocytes qui font le lit des réactions allo-immunes et non spécifiques (inflammation). La simple perfusion de la microcirculation du greffon a donc probablement un effet positif sur la survie des cellules endothéliales pendant la période d'ischémie froide. Cet effet a également été montré sur un modèle d'autotransplantation rénale chez le porc [42

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Cependant, le flux doit être contrôlé car des pressions trop élevées sont délétères et conduisent à des lésions vasculaires et glomérulaires.

On dispose donc aujourd'hui d'arguments scientifiques (expérimentaux et cliniques) solides pour développer l'emploi des machines de perfusion en transplantation rénale particulièrement pour les greffons marginaux (DDAC et DCE) pour lesquels la mise sur machine devrait être systématique ; tout en sachant qu'elle est déjà obligatoire pour le DDAC et fortement soutenue financièrement par un forfait spécialement mis en place pour le DCE.

Une des questions qui reste posée est de savoir si les paramètres de perfusion permettent de sélectionner les greffons et de prédire leur fonction.

Les paramètres utilisables sont l'index de résistance et le débit de perfusion exprimé en volume par minute et par unité de poids du greffon. On peut dire sans se tromper et de nombreux travaux convergent pour cela que plus bas est l'index de résistance et au plus haut est le débit de perfusion pour une pression de perfusion donnée (habituellement entre 30 et 35mm/Hg) meilleure est probablement la qualité du greffon [78

Cliquez ici pour aller à la section Références, 81

Cliquez ici pour aller à la section Références, 82

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Cependant, il semble difficile voire impossible d'établir une valeur seuil d'IR ou de débit qui permette de pronostiquer la NFP ou la RRF. Pour les greffons issus de DDAC et perfusés sur le système Waves® ou RM3®, nous avons pu déterminer que lorsque l'IR de résistance des reins étaient supérieur à 0,35, mieux valait réaliser une bigreffe de rein qu'une monogreffe qui est plutôt réservée aux IR inférieur 0,30 [83

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Cependant, l'absence d'arguments suffisamment convaincants doit nous conduire à retenir qu'en l'état les index de résistance lors de la perfusion des greffons ne peuvent être utilisés seul comme paramètres d'acceptation ou de refus d'un greffon. Ils doivent être analysés avec les autres paramètres du donneur et c'est la synthèse de l'ensemble qui permettra de prendre la décision d'acceptation ou de refus d'un greffon. De la même façon, les marqueurs biologiques ne sont pas reconnus comme déterminant dans la décision d'utiliser ou non un greffon même si certaines équipes prennent en compte l'alpha GST par exemple [84

Cliquez ici pour aller à la section Références] dans leur arbre décisionnel.

Une autre question posée est de savoir si nous devons continuer à perfuser à 4°C ou au contraire passer à la perfusion normothermique. De nombreux arguments physiologiques et expérimentaux plaident pour perfuser entre 20 et 32°C pour permettre de mieux évaluer la capacité de récupération fonctionnelle des greffons et de leurs systèmes enzymatiques [85

Cliquez ici pour aller à la section Références] ; cela permettrait par ailleurs d'utiliser des molécules ou des intrants durant la perfusion afin d'améliorer la fonction des reins. La perfusion normothermique imposant d'apporter de l'oxygène et des nutriments, il est évident qu'elle ne peut pas être réalisée selon les modalités appliquées à la perfusion hypothermique durant le transport de l'organe mais probablement dans des structures dédiées. La perfusion normothermique déjà utilisées pour d'autres greffes et notamment pour le poumon est également utilisée en transplantation rénale avec des résultats très encourageant dans l'équipe de Nicholson pour des greffons refusés par les autres équipes au Royaume-Uni [86

Cliquez ici pour aller à la section Références, 87

Cliquez ici pour aller à la section Références].

Nous n'aborderons pas dans cet article les modalités techniques de mise en place du greffon sur les machines qui ne peuvent pas être traitées dans ce chapitre.

Le marché français propose actuellement deux machines de perfusion hypothermique : la Waves® IGL, France et la LifePort® (ORS, États-Unis). Leur fonctionnement est sensiblement différent et il faut insister sur le fait que les paramètres de perfusion de l'une ne sont pas transposables à l'autre car le mode de calcul de l'index de résistance est différent. La principale différence entre les deux machines réside dans la façon de faire circuler la solution de préservation, la Waves® assurant une perfusion plus proche de la physiologie. Il est difficile, à ce jour, de déterminer les éventuelles conséquences de ces modalités de perfusion sur le greffon rénal et rien ne permet à ce jour de départager de façon claire les deux types de perfusion. L'argument du maintien d'une pression partielle en oxygène avec le système Waves®, qui permet probablement de mieux préserver les réserves en ATP que la Lifeport® pour laquelle la pression partielle en oxygène devient nulle après 4heures de perfusion est probablement à considérer en sachant que lifeport® travaille actuellement activement pour modifier son système et pour permettre un apport d'oxygène.

Concernant les solutions des conservations à utiliser sur les machines, elles portent un nom commercial différent mais sont similaires. Il s'agit de solutions de type extracellulaires qui correspondent à une solution d'UW (ou Belzer) dont les concentrations en sodium et en potassium ont été inversées. Le marquage CE des machines fait que leur fonctionnement est contraint à un liquide donné et qu'il n'est réglementairement pas possible d'en changer en pratique clinique faut autorisation de l'ANSM.

Sur le plan économique, l'analyse la plus aboutit méthodologiquement et probablement la plus cohérente a été réalisée par l'équipe qui a réalisé l'essai européen [88

Cliquez ici pour aller à la section Références]. En ne tenant compte que des coûts spécifiques à chaque méthode de préservation, l'analyse à court terme démontre que la préservation sur machine génère des économies puisque les coûts moyens ont été de 8668 $ dans le groupe machine de perfusion et de 11 294 $ dans le groupe préservation statique. La principale différence provenant du nombre de séances de dialyse évitées et d'un nombre moindre de réadmissions dans le groupe machine de perfusion.

 

Conclusion

Se fondant sur les résultats des études scientifiques et économiques en faveur de la conservation sur machine de perfusion, la communauté médicale française et l'Agence de la biomédecine ont obtenu que soit créé un financement spécifique pour la préservation sur machine des greffons de DCE, ce qui fait de la France le premier pays à s'être doté d'un mécanisme de remboursement de la perfusion d'organes. Parmi les questions organisationnelles, celle de la création de laboratoires de perfusion se pose. L'idée n'a pour le moment pas été retenue faute de modalités de financement. Cette organisation pourrait avoir de nombreux avantages, comme la mise en commun des machines, l'accès à la perfusion normothermique pour faire de la période de perfusion un banc d'essai du greffon, l'utilisation de molécules à visée diagnostique et ou thérapeutique et enfin, l'évaluation métabolique des greffons.

Dans une ère ou notre fonctionnement reste encore très artisanal, il faut probablement imaginer l'émergence de plateformes multiorganes régionales qui soient professionnalisées et qui assurent l'optimisation de la conservation et l'évaluation du greffon avant qu'il ne reparte vers le bloc opératoire pour être transplanté.

 

Déclaration de liens d'intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.

   
☆  Cet article fait partie intégrante du rapport « Les urologues et la transplantation rénale » du 110e Congrès de l'Association française d'urologie rédigé sous la direction de François Kleinclauss.

 



Tableau 1 - Composition des liquides de conservation.
Solutions  Plasma  Solution intracellulaire  Solutions de type intermédiaire  Solutions de type extracellulaire 
    UW  IGL-1  Polysol  Celsior  Lifor  HTK
(custodiol) 
CMRL1066
+1 %BSA 
HBSS+0,5 %BSA  SCOT
15 
Ions (mM)                      
Na+  140  30  125  120  100  98  15  144  119  118 
K+  125  30  15  15  15,8  10  5,3  2,1 
Mg++  0,8    13    0,8  1,08  1,2 
Ca++  2,5        0,25  0,17  0,015  1,8  0,9  1,75 
Cl-  104            50  126   
Tampons (mM)                      
SO42-  1,4    1,2        1,08   
KH2 PO4   3,2  25  25        2,16   
HCO3-  25              26  25  25 
HEPES        24           
Histidine        6,3  30    198  0,12     
Na3 PO4         21,7             
Molécules (mM)                      
Adénosiine      0,01         
Allopurinol                 
Alpha-tocophérol        0,0005             
Ac ascorbique        0,11        0,28     
Cholestérol                0,0005     
Coenzyme A                0,003     
Glucose              10,8  11 
Glutamate          20      0,51     
Glutathion    5,6      0,032     
Alpha-kétoglutarate                   
Lactobionate    100  100    80           
Mannitol          60    30       
K gluconate        20             
Raffnose    30  30  3,2             
Gluconate Na        75             
Tryptophane              0,048     
Colloïdes (g/L)                      
HES    50                 
PEG 20kDa                    15 
PEG 35kDA      20             
Albumine  42                   
Physico-chimie                      
pH  7,4  7,3  7,3  7,4  7,3  7,07  7,2  7,2  7,4  7,3 
Viscosité à 4°C    5,34  1,92    2,03    1,71  1,64  1,69  3,12 
Viscosité à 20°C  1,84  3,22  1,19    1,21    1,12  1,06  1,06  1,41 
Viscosité à 37°C    1,98  0,84    0,82    0,8  0,73  0,72  1,2 
Osmolarité (mOsm)  308  327  298    320    310  301  32  337 

 

 
 

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