Thérapie cellulaire de l'insuffisance sphinctérienne urétrale par autogreffe de cellules précurseur musculaire

29 juin 2004

Mots clés : insuffisance sphinctérienne, régénération, cellule satellite, thérapie cellulaire.
Auteurs : René YIOU (1, 2), Laurent ZINI (1, 3), Constant LECOEUR (1), Jacques BISERTE (3), Claude ABBOU (1), Antony ATALA (2), Dominique CHOPIN (1)
Référence : Prog Urol, 2004, 14, 93-99
Cet article a pour objectifs de faire le point sur les thérapies cellulaires des maladies musculaires et de décrire la démarche que nous avons adoptée pour développer le traitement de l'insuffisance sphinctérienne urétrale par autogreffe de cellules précurseur musculaire (cpm). Nos travaux se sont déroulés en plusieurs étapes successives comprenant : 1) l'étude comparative des mécanismes cellulaires de régénération des muscles striés squelettiques et du sphincter strié urétral et la mise au point d'une méthode d'extraction de cpm ; 2) la création d'un modèle animal de lésion sphinctérienne reproduisant les lésions de dénervation chronique et de fibrose responsables de l'insuffisance sphinctérienne chez l'homme ; 3) une étude de la biologie de greffe intra sphinctérienne de cpm extraites de muscles périphériques en prenant en considération les interactions entre ces cellules et le système nerveux périphérique.



Une nouvelle stratégie thérapeutique de l'incontinence urinaire d'effort a récemment été envisagée par plusieurs équipes [48, 55, 58, 59]. Son objectif est d'augmenter le nombre de fibres musculaires sphinctériennes fonctionnelles par une injection de cellules précurseur musculaire (cpm) extraites de muscles périphériques. Cette approche thérapeutique a été largement inspirée par les découvertes réalisées dans le cadre de la recherche sur les myopathies génétiquement déterminées. Ces travaux ont permis de mieux comprendre le mécanisme de la régénération des muscles striés squelettiques et la nature des cellules - les cellules précurseur musculaire - impliquées dans ce processus; il a été établi que l'injection de cpm saines pouvait non seulement modifier le profil génétique des muscles dystrophiques en fusionnant avec les fibres déficientes [34, 35], mais aussi augmenter leurs capacités contractiles [1]. L'injection de cpm est alors apparue comme un traitement prometteur pour de nombreuses myopathies génétiquement déterminées ou acquises, au premier rang desquelles figure l'insuffisance cardiaque [21, 32].

Un programme de recherche, développé à l'hôpital Henri Mondor depuis 1998, a eu pour objectif de mettre au point les bases anatomiques et biologiques du traitement de l'insuffisance sphinctérienne par greffe de cpm. Le but de cet article est de décrire l'état actuel des connaissances sur la régénération musculaire et la thérapie cellulaire des myopathies, puis d'exposer la démarche que nous avons entreprise pour développer la thérapie cellulaire de l'insuffisance sphinctérienne. Nous avons essentiellement considéré une double problématique : celle de la biologie de greffe intramusculaire de cpm, et les spécificités histopathologiques de l'insuffisance sphinctérienne, c'est-à-dire la dénervation chronique et la fibrose.

ETAT ACTUEL DES CONNAISSANCES SUR LA REGENERATION DES MUSCLES STRIES SQUELETTIQUES ET DU SPHINCTER STRIE URETRAL (Figure 1)

Figure 1 : Origine embryologique et régénération des muscles striés squelettiques. A : Les muscles striés squelettiques sont composés de fibres multinuclées qui peuvent régénérer grâce aux cellules satellites présentes sous leur membrane basale. L'origine embryologique des muscles et de leurs cellules satellites est classiquement attribuée aux myoblastes primitifs issus de la partie dorsale des somites, mais des travaux récents ont suggéré que les cellules satellites pouvaient aussi dévirer du système vasculaire embryonnaire. A l'âge adulte, toutes les cellules satellites ne sont pas au même stade de maturation, certaines d'entre elles étant déjà génétiquement engagées dans un processus myogéniques (rouge) alors que d'autres pourraient constituer une réserve de cellules souches multipotentes (vert). B : Après une lésion musculaire, les cellules satellites sont activées et prolifèrent puis fusionnent (C) pour former de nouvelles fibres musculaires multinucléés (D). D'autres cellules pourraient participer au processus de régénération musculaire à l'âge adulte (C), telles que les cellules souches médullaires, des cellules du système vasculaire ou présentes dans le tissu conjonctif. La contribution exacte de recrutement n'est pas encore clairement définie.

Les muscles striés squelettiques sont composés de fibres multinuclées ayant chacune un récepteur cholinergique unique connecté à une terminaison nerveuse. Après avoir été lésées, les fibres musculaires peuvent régénérer à partir de cellules présentes entre leur membrane plasmique et la lame basale: les cellules satellites. Une fibre du muscle Flexor brevis de rat possède environ 3 cellules satellites et sur une coupe transversale d'un muscle, 4 à 6% des noyaux associés aux fibres musculaires sont des noyaux de cellules satellites [6]. En cas de dommage musculaire, les cellules satellites s'activent et sont alors nommées myoblastes; ces cellules prolifèrent puis fusionnent avec les fibres lésées ou bien forment de nouvelles fibres musculaires multinucléés. Il s'agit là du schéma classique de la régénération musculaire. La recherche effectuée au cours des dix dernières années a apporté des éléments nouveaux sur l'origine et la diversité des cellules satellites ainsi que sur l'implication possible d'autres types de cellules dans la régénération musculaire, l'ensemble de ces cellules pouvant être regroupé sous le terme de cellules précurseur musculaire (cpm). Ces découvertes ont eu des implications majeures pour le développement des thérapies cellulaires des pathologies musculaires.

Il a été montré qu'il existait une grande diversité parmi les cellules satellites [14, 23, 37, 45]. Ces différences ont été notées entre muscles ayant des fonctions différentes [37] mais aussi entre cellules satellites d'une même fibre musculaire [23]. Par exemple, les cellules satellites des muscles de type I (fonctionnant en mode aérobie et ayant la capacité de développer une activité tonique prolongée) auraient des capacités de régénération inférieures à celles des muscles de type II (fibres anaérobiques rapidement fatigables) [45]. Ceci est à prendre en compte dans la physiopathologie de l'incontinence urinaire si l'on admet que les fibres musculaires sphinctériennes de l'homme sont de type I [22]. Par ailleurs, toutes les cellules satellites n'ont pas le même comportement in vitro, certaines d'entre elles fusionnant après une phase de prolifération plus ou moins courte alors que d'autres pourraient constituer une réserve de cellules souches myogéniques restant à un stade indifférencié [23].

Enfin, les cellules satellites ne sont pas les seules cellules impliquées dans la régénération musculaire. Ferrari et al. ont montré que des cellules souches médullaires sont recrutées lorsque un muscle est lésé et participent à la formation de nouvelles fibres [15]. La contribution effective de ce recrutement à la régénération musculaire n'est pas clairement définie, mais pourrait jouer un rôle crucial en cas de pathologie musculaire chronique. Gussoni a récemment rapporté le cas exceptionnel d'un homme ayant eu une greffe de moelle osseuse à la naissance en raison d'une aplasie médullaire et chez qui il a été découvert, à l'adolescence et à l'occasion de chutes à répétition, une myopathie de Duchenne de Boulogne [18]. Cette maladie musculaire étant habituellement létale (ou extrêmement invalidante) à l'âge à laquelle elle a été découverte, il est probable que la greffe de moelle osseuse ait protégé les muscles du receveur, en plus de traiter l'aplasie.

Le sphincter strié urétral est un muscle à part dont les capacités régénératives sont mal connues et doivent être analysées en tenant compte de ses origines embryologiques. En effet, il est classiquement admis que les fibres musculaires squelettiques et les cellules satellites proviennent de myoblastes embryonnaires issus de la partie dorsale des somites et qui colonisent les membres avant le 18ème jour post-coital chez la souris [38]. La majorité de ces myoblastes primitifs fusionnent pour former les premières fibres alors qu'une minorité d'entre eux restent dans un état quiescent pour former la population de cellules satellites responsables de la régénération musculaire à l'âge adulte. Selon Borirakchanyavat [7], les fibres musculaires du sphincter strié urétral ont une origine embryologique différente: elles résulteraient de la transdifférenciation des cellules musculaires lisses urétrales en fibres striées et par conséquent, proviendraient du mesoderme splanchnique et non des somites. Bien que peu documenté dans le sphincter, ce phénomène de transdiferenciation muscle lisse/strié a été décrit à plusieurs reprises dans l'oesophage [26, 36] et dans le sphincter de l'iris [51] où un agencement similaire de fibres musculaires lisses et striées est présent. Cette originalité embryologique a plusieurs implications. Elle pourrait expliquer l'innervation du sphincter strié de type végétatif - et donc tout à fait inhabituel pour un muscle strié - que certains auteurs ont observé [29], la transdifferenciation ayant entraïné un glissement de l'innervation initialement destinée aux fibres lisses vers des fibres striées.

Mais ces caractéristiques embryologiques posent avant tout la question des capacités régénératives du sphincter strié urétral, car selon la théorie classique, les cellules responsables de la régénération musculaire à l'âge adulte sont étroitement liées aux cellules de la myogenèse embryonnaire, et les cellules musculaires lisses de l'appareil urinaire post natal n'ont aucune tendance spontanée à former des fibres striées in vitro ou in vivo.

L'autre caractéristique embryologique posant la question de l'existence de cellules satellites dans le sphincter strié urétral est son développement tardif en comparaison des muscles environnants, aussi bien chez l'homme [8] que chez le rat [7]. Par exemple, il a été montré chez le rat que les premières fibres musculaires striées sphinctériennes apparaissent un peu avant la naissance [7], bien après la migration des myoblastes embryonnaires à l'origine des fibres musculaires et de leurs cellules satellites.

Jusqu'à présent, peu d'auteurs ont cherché à établir les capacités régénératives du sphincter strié urétral. Corvin a isolé et cultivé des cellules provenant de sphincters striés humains et montré qu'elles formaient des fibres se contractant avec une stimulation chimique, mais cette étude n'a pas confirmé l'expression de marqueurs spécifiques des muscles striés [10]. Nous avons récemment réalisé une étude de la régénération sphinctérienne chez le rat et la souris en utilisant la technique des fibres isolées [56]. Des cellules satellites sphinctériennes ont pu être identifiées par leur expression d'un marqueur spécifique (Pax7); elles expriment en quelques heures des gènes de différenciation myogénique (Myf5, MyoD) et forment après quelques jours des fibres musculaires spontanément contractiles et exprimant des marqueurs de muscle strié. Sur une coupe histologique de sphincter, les cellules Pax7+ sont repérables et, après injection d'une substance myotoxique ayant pour effet de détruire rapidement toutes les fibres musculaires (Notexine), prolifèrent puis fusionnent pour reformer de nouvelles fibres aboutissant à une régénération ad integrum en 3 semaines. Ainsi, bien qu'ayant une origine embryologique différente de celle des muscles squelettiques, le sphincter strié urétral dispose à l'âge adulte d'un programme de différenciation myogénique standard impliquant l'activation de cellules satellites intrinsèques.

Ces résultats ont des conséquences importantes. Ils remettent en cause les théories classiques sur l'origine embryologique des cellules satellites, et vont dans le sens des travaux récents de De Angelis qui a démontré l'existence de progéniteurs musculaires dans le système vasculaire et suggéré que certaines cellules satellites puissent dériver de cellules endothéliales [11]. Selon ces auteurs, la myogenèse embryonnaire et la régénération musculaire adulte pourraient ainsi être deux phénomènes indépendants, l'un sous contrôle des somites et l'autre du système vasculaire. En raison de ces origines embryologiques particulières, le sphincter urétral constitue un modèle tout à fait original pour l'étude des cellules satellites.

Mais ces résultats permettent avant tout de fournir une explication biologique à certains types d'insuffisance sphinctérienne post traumatique qui peuvent désormais être interprétés comme une incapacité des cellules satellites sphinctériennes à assurer une régénération efficace. Les raisons de cette défaillance restent à déterminer en fonction de l'étiologie, mais la mise en évidence d'un processus de régénération myogénique standard apporte de nouvelles perspectives de traitement de l'insuffisance sphinctérienne. Ceux-ci pourraient être basés sur l'injection intra sphinctérienne de facteurs de croissance connus pour stimuler électivement les cellules satellites ou bien le transfert de cellules satellites périphériques vers le sphincter urétral. A cette fin, nous avons précédemment montré à l'aide d'un modèle de lésion sphinctérienne transitoire que des cellules satellites provenant de muscles périphériques pouvaient s'intégrer aux fibres sphinctériennes en cours de régénération [55].

PROBLEMATIQUE GENERALE DE LA GREFFE

DE CELLULES PRECURSEUR MUSCULAIRE

Il a été démontré que la majorité des cpm injectées dans un muscle disparaissent au cours de la première heure, par ischémie, puis secondairement, vers la dixième heure, en raison de la réaction inflammatoire qu'elles engendrent [4, 44]. Au total, moins de 3% des cpm ont un réel potentiel myogénique in vivo, alors qu'in vitro, la grande majorité fusionne pour former de nouvelles fibres musculaires. Plusieurs moyens ont été proposés pour favoriser la prise de la greffe. Kinoshita a proposé l'utilisation d'immunosuppresseurs ou le conditionnement du muscle receveur par une lésion préalable pour favoriser la fusion rapide des cpm avec les fibres en cours de régénération [27]. Pouzet a montré que les résultats de la greffe de cpm étaient proportionnels au nombre de cellules injectées [40]. Quet a proposé d'enrichir la proportion de cellules myogéniques en éliminant les fibroblastes musculaires par une phase de preplating, et en transfectant les cellules afin qu'elles sécrètent une substance anti-inflammatoire [44]. Beauchamps [4] a cherché à définir les caractéristiques des cpm qui survivent à l'injection. Ils ont ainsi montré que ces cellules ont des caractéristiques de cellules souches, se divisant lentement en culture mais proliférant rapidement après greffe. Dans une autre étude [3], ces auteurs ont montré qu'un faible pourcentage de cellules satellites n'exprimait pas de marqueurs de différenciation myogénique et ont évoqué que cette sous-population puisse représenter les cellules souches musculaires. Jackson [25] a utilisé une méthode de sélection cellulaire par cytofluorimétrie (Fluorescence Activated Cell Sorter) et coloration nucléaire (Hoechst 33342) pour identifier, dans les muscles striés, une population de cellules ayant les mêmes caractéristiques physiques que les cellules souches hématopoiétiques de la moelle osseuse [17] : les cellules SP (Side Population). Ces cellules ont un transporteur membranaire MDR (Multidrug Resistance Protein) qui leur confère la capacité de rejeter le colorant Hoechst 33342. Les cellules SP musculaires et médullaires expriment des marqueurs communs tels que sca-1. En revanche, les marqueurs c-kit, CD-43 et CD-45 ne sont exprimés que par les cellules SP médullaires [19]. Les cellules SP musculaires et médullaires ont des propriétés de cellules souches multipotentes ; en particulier, les cellules SP musculaires sont capables de repeupler le compartiment hématopoiétique d'une souris irradiée de manière létale [25], tout en gardant la mémoire de leur origine [9]. Pour Gussoni [19], les cellules SP musculaires et médullaires peuvent convertir un nombre significatif de fibres musculaires de la souris mdx lorsqu'elles sont injectées par voie intra-veineuse. Jackson [24] a montré que les cellules SP médullaires peuvent se différencier en cardiomyocytes et en cellules endothéliales dans un modèle d'ischémie myocardique. Il est remarquable, dans chacune de ces études, qu'à peine un millier de cellules injecté par voie intraveineuse ait suffit pour obtenir des résultats significatifs.

Il existe donc, dans les muscles squelettiques, une population de cellules myogéniques - les cellules souches musculaires SP - résistantes à l'ischémie, proliférant lentement in vitro et rapidement in vivo, et capables de participer efficacement au processus de régénération d'un muscle lésé lorsqu'elles sont injectées localement ou par voie intraveineuse. La nature exacte de ces cellules n'est pas encore clairement établie. Il pourrait s'agir de : 1) la sous-population de cellules satellites n'exprimant pas les marqueurs de différenciation musculaire décrite par Beauchamps [3] et Petersen [39] ; 2) de cellules associées aux capillaires [5] ; 3) de cellules souches mésenchymateuses présentes dans le tissu conjonctif des muscles [2]. La mise au point d'une méthode d'extraction de cpm ayant des caractéristiques de cellules SP est, d'après les connaissances acquises en biologie musculaire fondamentale, un enjeu capital pour le développement de la thérapie cellulaire de l'insuffisance sphinctérienne.

Nous avons utilisé la technique de culture ultra-sélective de cellules satellites sur fibres musculaires isolées pour caractériser la diversité des cellules satellites (Figure 2). Une étude immunohistochimique a révélé que certaines cellules satellites expriment des marqueurs de cellules souches musculaires tel que sca-1. Ces cellules prolifèrent en culture avec des milieux usuels. Nous avons montré que 5-10% des cellules obtenues avec cette technique ont les caractéristiques cytofluorimétriques de cellules souches SP décrites par Gussoni [19]. Ainsi, nous pouvons affirmer qu'une partie au moins des cellules souches musculaires appartient au compartiment des cellules satellites, celles-ci pouvant être obtenues par une technique de culture d'explants de fibres musculaires.

Figure 2 : Culture de cellules satellites (cellules précurseur musculaire) à partir de fibres isolées. A : Aspect d'une fibre musculaire de souris en immuno-fluorescence après triple marquage des noyaux (DAPI, bleu), des cellules souches musculaires (sca-1, fluorescéine, vert) et cellules satellites différenciées (desmine, Texas Red, rouge). Certaines cellules satellites expriment des marqueurs de cellules souches tels que sca-1 (flèche blanche) alors que d'autres n'expriment que la desmine (flèches rouge). B : Après 2 jours en culture, des cellules satellites sca-1+ se divisent au contact des fibres natives puis s'en détachent (C). D : Au 7ème jour, les cellules satellites qui ont proliféré sont arrivées à confluence et commencent à fusionner. E : L'analyse par FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) des cellules obtenues au 7ème jour montre la présence de cellules ayant des caractéristiques de cellules souches SP (Side Population) se différenciant du reste des cellules (cellules MP pour Main Population) par leur faible émission de fluorescence. F : Au 10ème jour, les cellules satellites ont formé des myotubes matures exprimant a-actinine 2 (fluorescéine, vert). Grossissement initial: X10 [A, C, D, F], X40 [B].

Enfin, l'utilisation d'autres sources de cellules différenciables en tissu musculaire a pu être envisagée pour le traitement des myopathies. Young [60] et Pye [43] ont montré que la peau contenait des cellules souches différentiables en tissus musculaire, osseux, cartilagineux et capables de convertir des fibres musculaires de la souris mdx. La possibilité d'utiliser des cellules de la peau pour relancer un processus de régénération sphinctérienne apparaît comme une alternative séduisante en raison de la simplicité du prélèvement.

PROBLEMATIQUE DE LA GREFFE DE CELLULE PRECURSEUR MUSCULAIRE POUR LE TRAITEMENT DE L'INSUFFISANCE SPHINCTERIENNE

Les principales études sur la biologie de greffe de cpm ont été réalisées chez la souris mdx, qui représente le modèle murin de la myopathie de Duchenne de Boulogne. Cette pathologie est responsable de cycles de dégénérescence-régénération musculaire continus s'expliquant par une délétion du gène de la dystrophine qui entraïne une fragilisation de la membrane des fibres. Chaque contraction musculaire aboutit ainsi à une destruction de fibres musculaires avec activation perpétuelle des cellules satellites aboutissant à un épuisement progressif des réserves [23]. Les terminaisons nerveuses ne sont pas affectées par ce processus [49]. Des cpm saines (dystrophine+) injectées au cours d'un cycle de régénération musculaire peuvent s'incorporer aux fibres en cours de formation et apportent ainsi le gène de la dystrophine manquant.

L'altération musculaire responsable de l'insuffisance sphinctérienne est différente et probablement plus stable, sans cycle de dégénérescence-régénération. Des études histopathologiques et électrophysiologiques ont mis en évidence, dans les muscles périnéaux et les organes pelviens de femmes incontinentes, des anomalies neuromusculaires mal définies mais associant vraisemblablement et à divers degrés, une dénervation chronique [16, 22], une altération primaire des fibres musculaires avec fibrose [13, 22] et une dégradation des tissus conjonctifs [20, 50]. Snooks a démontré par une étude électrophysiologique que l'accouchement traumatique, qui représente un des principaux facteurs de risque de l'incontinence urinaire, est responsable d'une dénervation des muscles du périnée [47]. Parks a très clairement mis en évidence une atteinte de type neuropathique prédominante dans le sphincter anal en cas d'incontinence fécale [33]. Prat-Pradal a mis en évidence des lésions mixtes neuropathique et/ou myopathiques dans le sphincter de femmes incontinentes [41]. Nous avons étudié les altérations histologiques présentes dans les muscles du périnée d'une souris transgénique présentant un trouble de la statique pelvienne [54]. Des lésions myopathiques localisées à certains muscles ont été observées sans qu'il soit possible d'éliminer formellement une participation neurogène.

La capacité des cpm musculaires à se développer et former des fibres musculaires fonctionnelles dans un contexte de dénervation chronique n'a encore jamais été évaluée. Il a été suggéré, par des études in vitro, que les cellules satellites en cours de maturation sécrètent des facteurs de croissance nerveuse [31], mais ceci n'a encore jamais été démontré in vivo. Or, l'état d'innervation est un facteur décisif dans le processus de régénération des muscles striés squelettiques, car il conditionne l'activation des cellules satellites [28], la maturation des myofibres régénérées [12] et enfin leur propriété contractile [52].

La restitution de la fonction d'un muscle à la fois dénervé et fibrosé et sans processus actif de dégénérescence/régénération constitue la principale originalité de cette approche thérapeutique par auto greffe de cpm.

CREATION DE MODELE DE LESION SPHINCTERIENNE ET RESULTATS PRELIMINAIRES D'AUTOGREFFE DE CELLULES PRECURSEUR MUSCLAIRE

Plusieurs auteurs ont tenté de développer chez un quadrupède une lésion sphinctérienne reproduisant les anomalies histopathologiques de l'insuffisance sphinctérienne. Sievert a reproduit un accouchement prolongé en gonflant un ballonnet dans le vagin de rates [46]. Lee a réalisé une dénervation sphinctérienne par section franche du nerf sciatique [30], mais cette lésion n'est pas, selon nous, très représentative d'une lésion de dénervation périnéale par étirement. Nous avons pris parti de faire une lésion sphinctérienne par électrocoagulation au bistouri électrique chez le rat mâle, reproduisant une lésion iatrogène chirurgicale, pour évaluer l'autogreffe de cpm [58]. Bien que cette lésion ne soit pas à l'origine de la plupart des incontinences rencontrées, elle entraïne une destruction totale et irréversible des fibres musculaires, des terminaisons nerveuses et des cellules satellites sphinctériennes, si bien qu'après une phase inflammatoire, une fibrose irréversible se développe sans aucun signe de régénération [58]. Elle représente en quelque sorte la pire lésion musculaire qu'un muscle puisse subir.

Nous avons injecté des cellules satellites obtenues d'un muscle de la patte par la technique des fibres isolées dans le sphincter préalablement lésé du même animal (Figure 3). Les cellules injectées ont été infectées par un adénovirus porteur du gène de la b-galactosidase afin de pouvoir suivre leur évolution in vivo. Elles se différenciaient dans le sphincter lésé en fibres musculaires multinucléées co-exprimant la b-galactosidase et des marqueurs de différenciation myogénique terminale (Figure 3). Ces fibres musculaires avaient des récepteurs à l'acétylcholine connectés à des terminaisons nerveuses, l'ensemble pouvant être considéré comme des unités motrices. La fonction sphinctérienne a été étudiée en combinant un bilan urodynamique (mesure du Leak Point Pressure in situ) avec et sans stimulation électrique des pédicules neurovasculaires du sphincter strié urétral. L'électrocoagulation d'un hémi sphincter entraïnait une perte définitive de la contraction de l'hemisphincter lésé et une incapacité du sphincter à maintenir une augmentation de pression vésicale. L'injection de cpm permettait la restitution de 41% de la valeur sphinctérienne normale en un mois. Ces résultats histologiques et fonctionnels démontrent que des cpm injectées peuvent avoir une action trophique sur le système nerveux périphérique qui en retour interagit avec les cellules musculaires en développement pour restituer des unités motrices. Ils montrent aussi que les cpm peuvent se développer dans un contexte de fibrose. La persistance des fibres à plus long terme n'a pas pu être établie dans notre étude car l'expression de la s-galactosidase induite par une infection adénovirale est transitoire. Yokoyama a utilisé un vecteur rétroviral donnant une expression stable pour montrer que les cellules injectées persistaient au delà de 3 mois [59]. La même équipe a aussi montré que la période critique d'une greffe de cpm était comprise dans les dix premiers jours, date après laquelle, le nombre de fibres n'évoluaient plus [39].

Figure 3 : Injection de cellules satellites (cellules précurseur musculaire) autologues dans un modèle de lésion sphinctérienne chez le rat : mise en évidence de la formation d'unités motrices. A : Les cellules satellites peuvent être infectées par un adénovirus codant pour le gène de la b-galactosidase. B : Les cellules satellites infectées se différencient in vitro en myotubes colorés en bleu après incubation avec le substrat de la b-galactosidase (solution de X-Gal). C, D, E, F : Injection de cellules satellites autologues infectées par un adénovirus b-galactosidase dans un sphincter urétral de rat préalablement lésé par électrocoagulation. Trente jours après la greffe, les cellules injectées ont formé des fibres musculaires b-galactosidase+ (C). D, E: Mise en évidence, sur cette même coupe, de la formation d'unités motrices (flèches blanches) caractérisées par des fibres musculaires b-galactosidase+ avec une plaque motrice (D, bungarotoxine, vert) connectée a une terminaison nerveuse (E, anti PGP9.5, Texas Red, rouge). F : Les trois plaques motrices des figures D et E (flèches blanches) sont montrées à plus fort grossissement. Grossissement initial: X10 [A, B, C, D, E] et X40 [F].

FUTURES DIRECTIONS ET PERSPECTIVES

Une étude de la biologie de greffe cellulaire intra-sphinctérienne est désormais nécessaire chez le gros animal afin de déterminer le nombre de cellules à injecter pour reconstruire un volume sphinctérien cliniquement significatif. Cette étude devra aussi s'attacher à mettre en évidence le type histologique des fibres musculaires résultant de la différenciation des cpm. La restitution d'un sphincter physiologique implique une certaine plasticité des cpm, c'est-à-dire une capacité à former des fibres de type I ayant une activité tonique basale. S'il est bien établi que la greffe de cpm peut améliorer la force de contraction maximale électrostimulée d'un muscle squelettique détruit (contraction tétanique) [53], il reste à déterminer si le tonus basal du muscle est aussi modifié. Autrement dit, doit on attendre de la greffe de cpm une simple augmentation du gain de retenue ou bien une amélioration du tonus permanent ? La création d'un modèle animal d'insuffisance sphinctérienne chez la truie pourrait permettre de répondre à ces questions en raison des similitudes morphologiques entre le sphincter de cet animal et celui de l'homme (manuscrit en préparation).

Il n'est pas impossible que certains artifices soient nécessaires pour augmenter le volume musculaire généré. Une injection combinée de cpm et d'autres types de cellules, telles que des cellules endothéliales ou des cellules souches nerveuses [57], pourrait favoriser l'angiogenèse ou la régénération nerveuse. Par ailleurs, l'utilisation de matrices extracellulaires présentées sous forme de gels ou de bandelettes biodégradables contenant des facteurs de croissance pourrait aussi être envisagée.

En cas de résultats concluants chez le gros animal, la place de la thérapie cellulaire parmi les traitements actuels de l'incontinence urinaire devra être définie précisément. Plusieurs applications peuvent être envisagées. Chez les femmes souffrant d'incontinence urinaire par insuffisance sphinctérienne ou hyper mobilité vésico-urétrale, l'injection de cpm pourrait agir en renforçant la tonicité du sphincter ou des tissus musculo-aponévrotiques para-urétraux. Elle serait indiquée en complément d'une rééducation pelvienne. En fonction du gain réel obtenu sur la tonicité sphinctérienne, la greffe de cpm pourrait être, dans certains cas, une alternative à l'implantation d'un sphincter artificiel, voire à la mise en place d'une bandelette sous urétrale, dans la mesure où les cellules suspendues dans un faible volume seraient à priori injectées sans anesthésie.

Une attention particulière mérite d'être retenue concernant les lésions sphinctériennes causées par la radiothérapie car il a été établi chez l'animal que la destruction préalable du muscle par irradiation augmentait considérablement la prise d'une greffe de cpm, pour des raisons encore non clairement élucidées [53]. Dans la situation particulière d'une insuffisance sphinctérienne post- radiothérapie, les traitements sont souvent décevants et difficiles, et l'autogreffe de cpm pourrait trouver une place de choix. Chez l'homme, l'injection de cpm apparaît comme un traitement prometteur de l'insuffisance sphinctérienne après résection de prostate ou traitement du cancer de prostate en raison de l'absence de traitement satisfaisant.

L'utilisation de cpm pourrait aussi trouver des applications pour d'autres pathologies urologiques telles que les vessies acontractiles pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace. Enfin, la facilité avec laquelle il est possible de transfecter les cpm pour qu'elles secrètent divers facteurs de croissance [42] apportera probablement de nouvelles perspectives de traitement par thérapie génique en Urologie.

Conclusion

Le sphincter striée urétral, bien qu'ayant une origine embryologique tout à fait originale, peut régénérer suivant les mêmes mécanismes biologiques que les muscles striés squelettiques, c'est-à-dire par activation de cellules satellites intrinsèques.

L'insuffisance sphinctérienne résulte de lésions musculaires complexes et chroniques associant fibrose, dénervation et lésions myopathiques.

Des cellules satellites peuvent être isolée de muscles squelettiques, certaines d'entre elles ont des caractéristiques de cellules souches musculaires SP (Side Population) connues pour leurs propriétés myogéniques in vivo.

Une autogreffe de cellules satellites extraites de muscles de la patte dans le sphincter urétral lésé de manière irréversible aboutit à la formation de nouvelles fibres musculaires. La maturation des cellules injectées a probablement une action trophique sur l'innervation locale qui en retour restitue des unités motrices fonctionnelles.

La poursuite du projet consistera à restaurer un volume sphinctérien urétral fonctionnel cliniquement pertinent chez un animal dont le sphincter urétral a des caractéristiques morphologiques proches du sphincter de l'homme.

Références

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Remerciements : Ce travail a été financé par la Fondation pour l'Avenir.