Solutions ioniques et possibilités de prévention des cystites récidivantes

08 juillet 2006

Mots clés : P-fimbriae, adhérence, complexe ionique, Vessie, Infection, cystite.Niveau de preuve : 5
Auteurs : BENOIT J.M., BERGES J.L., FALCOU M., JEANJEAN P., JOURFIER C
Référence : Prog Urol, 2006, 16, 2, 163-167
Objectif : Connaissant l'importance du phénomène d'adhérence bactéries - cellules urinaires dans la genèse des infections du tractus urinaire, vérifier l'hypothèse d'un abaissement de cette adhérence par un complexe ionique : l'eau minérale de La Preste.
Sujets et méthode : Il a été comparé en milieu neutre et en eau minérale, l'adhérence in vitro d'un Escherichia coli P-fimbrié (à pili Gal-Gal) sur les cellules urinaires de femmes présentant des cystites récidivantes ; et l'interaction de la même bactérie avec des micro-particules enrobées de récepteurs Gal-Gal dans les mêmes milieux. In vivo, les cellules urinaires de 13 femmes à bilan urologique normal, ayant des cystites récidivantes et une capacité d'adhérence élevée, ont été testées trois fois par jour vis-à-vis de la même bactérie, au premier et au dernier jour de leur cure thermale.
Résultats : In vitro, le pré-traitement des cellules urinaires par l'eau minérale a produit un abaissement d'adhérence (p = 0,001), alors que le pré-traitement des bactéries par la même eau a été sans effet. In vivo, l'adhérence baisse significativement (p = 0,021) 2 à 3 heures après ingestion d'eau minérale ; et un abaissement global significatif d'adhérence (p = 0,016) a été mesuré entre le premier et le dernier jour de cure.
Conclusions : Ces données montrent une diminution de l'adhérence (de type P) entre Escherichia coli et cellules urinaires en présence d'eau minérale de La Preste, par action sur la cellule urinaire. Elles indiquent le rôle probable du soufre et de la silice dans ce processus, alors qu'une modulation d'adhérence par des ions n'est connue à ce jour que pour le calcium et le magnésium.

Les infections du tractus urinaire (ITU) et parmi elles les cystites récidivantes sont des pathologies fréquentes [1-3], dont le coût économique est lourd en termes de consommation de soins et de médicaments [4, 5]. Les progrès réalisés dans la compréhension de leur mécanisme et l'utilisation répétée d'antibiotiques, avec son risque d'émergence de résistances, sont deux raisons majeures qui ont amené à s'intéresser récemment aux possibilités de prévention des ITU par des traitements non-antibiotiques.

Se sont ainsi développées des recherches sur les possibilités de vaccins [6-9] pour éviter les récidives d'ITU. L'attention s'est également portée sur l'utilisation de certains jus de fruits - airelles ou myrtilles [10-13] - qui sont riches en pro-anthocyanidines (tanins), molécules susceptibles d'interférer favorablement sur le processus d'installation des ITU [14].

Certaines bactéries telles Escherichia Coli font partie de la flore saprophyte colique. Elles peuvent, lors de modifications du milieu intestinal, acquérir des caractères de pathogénicité [15] qui leur permettent de coloniser le système urinaire. Chez la femme, où le processus est le mieux compris, cette colonisation débute sur la muqueuse vulvo-vaginale. Schématiquement les principaux caractères de pathogénicité sont l'acquisition de capacités métaboliques supplémentaires permettant une "survie prolongée" hors de l'intestin ; et l'acquisition de "poils" (dits pili ou fimbriae) qui autorisent la fixation sur des cellules, en l'occurrence vaginales puis urétrales et vésicales, et donc la colonisation des muqueuses correspondantes [16, 17]. Du côté de la femme prédisposée aux ITU existe une susceptibilité particulière [18], qui se traduit par l'existence de nombreuses structures chimiques spécifiques, sur les cellules urinaires et vaginales, ces récepteurs permettant la fixation des bactéries par le biais de leurs fimbriae. Le système de fixation le plus "redoutable" est constitué par les P-fimbriae qui donnent au germe la capacité potentielle d'atteindre le rein [19]. A ces P-fimbriae correspondent chez les femmes sujettes à ITU des récepteurs constitués d'un di-galactose, d'où leur autre dénomination de pili Gal-Gal. Ce phénomène est appelé adhérence bactéries-urothélium (de type P dans le cas des pili Gal-Gal) et constitue une partie essentielle du processus d'installation d'une ITU.

Toutes les recherches mentionnées plus haut s'appuient sur les données de pathogénie qui viennent d'être résumées et se proposent d'obtenir une diminution des ITU par inhibition du processus d'adhérence, en particulier de l'adhérence de type P. Toutefois les travaux d'Apicella et Sobota [20] n'ont pas suscité à notre connaissance de développements notables. Ces auteurs démontrent que de simples ions peuvent interférer avec le processus d'adhérence : en présence de calcium l'adhérence est majorée in vitro comme in vivo alors qu'elle est diminuée en présence de magnésium.

Le présent travail se propose de déterminer si une modulation de l'adhérence bactérie-urothélium peut être observée avec le complexe ionique que constitue une eau minérale.

Il étudie l'eau minérale de La Preste (Pyrénées-Orientales), station thermale réputée obtenir une diminution du rythme des cystites récidivantes après traitement thermal [21].

Sujets et methode

Méthode de mesure de l'adhérence.

Les mesures d'adhérence ont été réalisées selon le protocole utilisé par le laboratoire de Bactériologie du C.H.U de Toulouse-Rangueil, qui a fourni la bactérie à P-fimbriae utilisée tout au long de ce travail (Escherichia coli référencé R9). Les urines sont recueillies et centrifugées et le culot obtenu est lavé 2 minutes en milieu PBS (phosphate buffered saline : sérum salé tamponné à pH 7,4). A l'issue d'une nouvelle centrifugation, 2 ml de PBS sont ajoutés et l'ensemble est agité une minute. Deux nouveaux lavages d'une minute permettent d'éliminer le mucus du culot. Une suspension en milieu PBS de 0,5 ml de cellules urinaires lavées est ainsi obtenue, et amenée à la concentration de 10.4 à 10.5 cellules/millilitre. Parallèlement une suspension de 0,5 ml d' Escherichia coli R9 à la concentration de 10.8 à 10.9 bactéries/ml est préparée en milieu PBS. Après mise en contact et agitation des deux suspensions durant une heure à 37°C., 3 lavages par centrifugation, pour un total de 6 minutes, éliminent les bactéries non fixées aux cellules. Mise sur lame et lecture terminent la manipulation : le biologiste procède à l'examen microscopique de 100 cellules urinaires, et établit de cette façon le rapport d'adhérence qui indique le nombre de cellules couvertes de bactéries pour 100 cellules examinées. Selon cette technique, l'adhérence est considérée comme élevée lorsque le rapport d'adhérence est égal ou supérieur à 25 pour 100 cellules.

Information et accord des patientes

Toutes les patientes dont les urines ont été recueillies au cours de cette étude ont été informées des buts de ce travail et ont accepté les prélèvements qu'il nécessitait. En raison de la bénignité du geste demandé, l'avis d'un Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale n'a pas été sollicité.

Etude in vitro

Préparation des cellules urinaires dans différents milieux

Des urines provenant de 30 femmes présentant des cystites récidivantes documentées bactériologiquement, correctement explorées (au minimum une urographie intra-veineuse complète, une glycémie et une créatininémie normales) sont récoltées en flacon stérile et l'absence d'ITU est vérifiée à l'aide d'une bandelette nitrites-leucocyte estérase. Après centrifugation, les cellules urinaires sont isolées et divisées en deux lots. Pour l'un des lots, les mesures d'adhérence sont réalisées selon la technique décrite ci-dessus en milieu PBS. Pour l'autre lot la même technique est appliquée en utilisant de l'eau minérale native lors de la préparation de la suspension cellulaire. Selon les données de la littérature [12], aucun ajustement physico-chimique, en particulier de pH n'est nécessaire (pH 7,4 pour le milieu PBS et 8 pour l'eau minérale). Les deux milieux sont amenés à une températures de 37°C lors des manipulations. Les tests d'adhérence sont réalisés par une laborantine ignorant le milieu de préparation des cellules urinaires.

Préparation des bactéries dans différents milieux

Des Escherichia coli R9 sont incubés à 37°C. durant des temps différents (5 minutes, 60 minutes, 120 minutes) dans quatre milieux différents : PBS, eau minérale native, eau minérale vieillie (prélevée 48 heures auparavant), eau du commerce (Volvic®).

Une goutte de chaque préparation est ensuite déposée sur une lamelle de PF test®.

Le PF test® (Orion Diagnostica, Espoo, Finlande) est constitué d'une lamelle transparente portant deux zones distinctes de réactif desséché. L'une comporte des micro-particules de latex sur lesquelles sont fixés des récepteurs Gal-Gal, l'autre est une zone témoin portant des micro-particules dépourvues de récepteurs. La ré-hydratation de ces deux zones avec une goutte de suspension contenant des bactéries à P-fimbriae produit en quelques minutes une agglutination macroscopique de la seule zone comportant des récepteurs Gal-Gal.

Cinq tests utilisant le PF test® sont réalisés avec chacune des solutions précédentes, à chaque temps d'incubation, soit au total 60 tests. Les agglutinations sont contrôlées par une personne ignorant le milieu d'incubation des bactéries.

Etude in vivo

Sujets

Les résultats du laboratoire fournissent deux indications. Ils montrent qu'on ne peut espérer observer un abaissement éventuel d'adhérence in vivo que si celle-ci est initialement haute ; et conduisent à sélectionner des femmes chez qui le rapport d'adhérence initial est au moins de 25 pour 100 cellules vésicales. Ils permettent aussi de calculer qu'il faut quatorze femmes présentant une telle adhérence pour détecter une éventuelle diminution de celle-ci.

31 femmes ayant des cystites récidivantes (au moins 3 crises dans l'année précédente, caractérisées cliniquement et bactériologiquement), correctement explorées (au minimum urographie intra-veineuse complète et normale), non immuno-déprimées, sans perturbation de leur glycémie, créatininémie, hémogramme et vitesse de sédimentation, ont donc été testées à leur première arrivée à La Preste.

Seules 13 de ces femmes ont été retenues pour cette étude en raison de leur rapport d'adhérence élevé (25 cellules pour 100 au minimum) lors des tests pratiqués avant toute prise d'eau minérale.

Méthode

Les urines de ces 13 sujets sont recueillies le matin (avant toute prise d'eau minérale), à midi (2 à 3 heures après prise d'eau minérale), à 18 heures (9 à 12 heures après).

Ces prélèvements sont effectués au premier jour (J1) et au dernier jour de la cure thermale (J20) en flacon stérile et l'absence d'ITU est vérifiée à la bandelette. Chaque fois que possible des urines sont aussi récoltées la veille de J1. Toutes ces urines sont adressées au laboratoire dans des flacons anonymes numérotés, et sont testées pour leur adhérence en milieu de référence PBS, selon la procédure décrite précédemment.

Etude statistique

Le test de Student est utilisé pour la comparaison de deux groupes de valeurs. Le test de Friedman est utilisé pour la comparaison de trois groupes de valeurs, avec comparaisons multiples selon la méthode de Dunn.

Résultats

Adhérence in vitro en milieu PBS versus eau minérale

Pour 30 culots d'urine dédoublés, le rapport d'adhérence est en moyenne de 27,1 pour 100 cellules (écart-type 23,9) en milieu PBS contre 21,0 (écart-type 18,4) en présence d'eau minérale (p = 0,001). Il faut aussi noter que l'abaissement d'adhérence en présence d'eau minérale est d'autant plus marqué que l'adhérence est élevée.

Les mesures d'adhérence en milieu de référence PBS ont été ordonnées de la plus petite à la plus grande. Pour plus de clarté, la moyenne des 5 plus petites valeurs a été calculée ainsi que la moyenne des 5 valeurs correspondantes en eau minérale. Il a été procédé de même pour les 5 valeurs suivantes, et ainsi de suite jusqu'à la trentième mesure.

On obtient de cette façon les données du Tableau I : sur chaque ligne du tableau sont portées les moyennes, les valeurs extrêmes entre parenthèses, correspondant aux 5 mesures considérées.

Adhérence in vitro après incubation des bactéries

A concentration suffisante, l'Escherichia coli R9 à P-fimbriae utilisé dans toutes les expériences décrites ci-dessus provoque toujours en quelques minutes une agglutination sur la zone réactive du PF test® lorsqu'il est incubé en milieu de référence PBS, quel que soit le temps d'incubation préalable (5 minutes, 60 minutes ou 120 minutes).

L'agglutination est également toujours obtenue en quelques minutes avec les Escherichia coli R9 à concentration suffisante, pré-incubés dans l'eau minérale native, l'eau minérale vieillie, l'eau de Volvic®, que l'incubation préalable ait été de 5 minutes, 60 minutes ou 120 minutes.

L'agglutination n'est modifiée ni par le milieu d'incubation de la bactérie, ni par la longueur du temps de contact préalable bactérie-milieu liquide.

Adhérence in vivo après boisson d'eau minérale

Des mesures d'adhérence avant toute prise d'eau minérale, 2 à 3 heures après boisson d'eau minérale (150g en moyenne), et à distance de celle-ci (9 à 12 heures) sont obtenues à J1 chez 13 femmes. Les résultats de ces mesures sont reportés dans le Tableau II. Sur chaque ligne sont indiqués, aux différents temps de mesure, la valeur moyenne d'adhérence et l'écart-type correspondant. Le test global est significatif (p = 0,021).

La comparaison des trois les groupes de valeurs entre eux indique que la seule différence significative est la différence : adhérence avant boisson d'eau minérale versus adhérence mesurée 2 à 3 heures après boisson.

Evolution in vivo de l'adhérence entre J1 et J20

Toutes les valeurs d'adhérence mesurée à J1 ont été comparées à toutes les valeurs d'adhérence mesurée à J20. Du jour J1 au jour J20, les 13 patientes ont bu de l'eau minérale chaque matin, à dose progressivement croissante (De 150 g à J1, jusqu'à 500 à 600grammes par jour en moyenne).

Les résultats sont reportés dans le Tableau III. L'adhérence à J20 est significativement plus basse que l'adhérence à J1 (p = 0,016).

Discussion

L'ensemble de ces résultats suggère que la solution ionique constituée par l'eau minérale de La Preste produit une diminution de l'adhérence bactérie-urothélium entre un Escherichia coli P-fimbrié d'une part, et les cellules vésicales de femmes présentant des cystites récidivantes d'autre part.

L'agglutination observée lors de l'utilisation du PF test® visualise la liaison des P-fimbriae bactériens avec leurs récepteurs Gal-Gal, c'est-à-dire le phénomène d'adhérence lui-même. Or ce phénomène n'est aucunement influencé par la mise en contact préalable, qu'elle soit brève ou prolongée, de la bactérie avec différents milieux liquides, dont l'eau minérale. A l'inverse le pré-traitement des cellules vésicales par de l'eau minérale aboutit à une diminution des adhérences mesurées par rapport à celles observées en milieu de référence PBS. Ces données de laboratoire montrent donc que l'action observée se produit au niveau de la cellule urinaire.

Le laboratoire suggère que cet effet est assez rapide puisqu'il est mis en évidence lors d'une manipulation qui dure moins de 1 heure 30 (préparation des cellules urinaires et mise en contact avec la bactérie R9). Cette donnée est cohérente avec les mesures in vivo avant et après boisson d'eau minérale. L'adhérence est abaissée significativement 2 à 3 heures après boisson d'eau minérale, et remonte à distance de celle-ci. De plus la boisson quotidienne d'eau minérale pendant 20 jours aboutit finalement à une diminution significative de l'adhérence à l'issue de ces 20 jours.

Les résultats observés ici sont tout à fait compatibles avec les observations et mesures d'Apicella et Sobota [20]. Ces deux auteurs démontrent au laboratoire une augmentation significative de l'adhérence de type P en présence de calcium à concentration suffisante (plus de 10 millimoles, soit 400 mg/l) et montrent que l'action du calcium se produit au niveau des cellules urinaires. En testant à plusieurs reprises une femme sans antécédents d'ITU, ils montrent qu'une supplémentation calcique produit une élévation significative d'adhérence, comparable à celle obtenue au laboratoire ; et que l'ingestion d'une préparation contenant 500 mg de calcium produit un pic de calciurie après 2 heures, déclinant lentement en une dizaine d'heures, et également un pic d'adhérence 2 heures après l'ingestion de calcium. Ces auteurs montrent enfin qu'in vitro une diminution significative d'adhérence est obtenue en présence de magnésium, alors que le sodium, le potassium et le chlore sont sans effet. Il est donc clair qu'une modulation de l'adhérence de type P par de simples ions est possible.

Les expériences utilisant l'eau minérale rapportées plus haut montrent parallèlement une action au niveau cellulaire ; et aussi un abaissement d'adhérence d'une dizaine d'heures, maximal 2 à 3 heures après ingestion d'eau minérale, et donc suggestif de l'élimination d'un principe actif. Il est intéressant de tenter d'identifier ce principe.

L'eau minérale de La Preste contient en quantité notable les éléments suivant :

= silice : 40 mg/l ; soufre et composés soufrés : 40 mg/l ;

= anions : bicarbonates : 40 mg/l ; carbonates : 15 mg/l ; sulfates : 9 mg/l ; chlorures : 9 mg/l ;

= cations : sodium 138 mg/l ; calcium : 2,84 mg/l ;

et à l'état de traces : potassium, magnésium, fer, manganèse, zinc ...

Selon les résultats d'Apicella et Sobota [20] la responsabilité des ions chlore, sodium et calcium ainsi que des éléments-traces dans tout effet d'abaissement d'adhérence est exclue. La responsabilité des anions chlorures, sulfates, carbonates, bicarbonates sur ce même effet est envisageable. En fait leur ancienne et large utilisation, en particulier en gastro-entérologie, n'a jamais permis d'observer cliniquement une réduction des ITU. Leur possible effet sur l'adhérence paraït ainsi bien improbable.

Les données rapportées ici suggèrent donc l'hypothèse d'une baisse d'adhérence imputable à la silice, ou au soufre, ou à l'association de ces deux éléments.

Les possibilités de prévention des ITU hors antibiothérapie sont limitées. La mise au point de vaccins anti-pili n'a guère dépassé le stade du laboratoire [7-9] Une préparation vaccinale de germes uropathogènes lyophilisés (OM-89®), développée en Allemagne, paraït prometteuse à l'issue de ses premiers essais cliniques [6]. Le jus d'airelles ou de myrtilles (ou canneberges ou cranberries) a démontré au laboratoire ses capacités à diminuer l'adhérence de type P [11-13] grâce à sa richesse en pro-anthocyanidines trimères [10, 14]. Si sa consommation a le mérite de la simplicité, son mode d'action sur le germe uropathogène [22, 23] paraït conduire à une prise continue du produit, actuellement plus onéreuse que certaines antibiothérapies filées. En outre les essais cliniques réalisés à ce jour ne sont pas convaincants [24-27] et les doses quotidiennes de pro-anthocyanidines nécessaires ne sont pas définitivement établies.

Conclusions

Les cystites récidivantes affectent selon diverses estimations au moins 500.000 à 600.000 Françaises [2, 3] et pèsent sur les finances de l'Assurance Maladie. La prévention des ITU récidivantes par une antibiothérapie filée prolongée a largement fait ses preuves. Outre la possibilité d'effets secondaires, elle fait courir le risque d'une résistance des bactéries [1, 3, 16].

En dehors de l'antibiothérapie, seuls deux produits paraissent assez proches de l'application en pratique courante : le jus d'airelle / myrtille et l'OM-89® [6].

La piste des ions, pour prévenir les ITU, est-elle donc une alternative à prendre en considération ? Magnésium [20], silice et soufre d'après les données rapportées ci-dessus, plaident en ce sens. Mais il s'agit là de données préliminaires qui ne peuvent fournir qu'une orientation. Et surtout on ne peut exclure que d'autres ions aient aussi la capacité de modifier favorablement le processus d'adhérence bactéries-urothélium. Plus généralement l'adhérence bactéries-cellules est un phénomène ubiquitaire qui constitue une étape fondamentale dans la colonisation et l'infection de toutes les muqueuses [28]. La recherche systématique d'ions susceptibles de modifier ce processus pourrait ainsi constituer une voie de recherche supplémentaire ; et peut-être déboucher sur une méthode simple pour prévenir les infections des muqueuses, y compris l'urothélium.

Nos très vifs remerciements aux Prs. G.Chabanon, A. Jardin et P. Plante pour leur aide durant la préparation et la réalisation de ce travail.

Un grand merci à Mesdames T. Bousquet et M. Klotz pour leur patient travail de laboratoire.

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