Potentialisation du traitement par ultrasons focalisés de l'adénocarcinomeprostatique par une chimiothérapie concomitante associantestramustine phosphate et paclitaxel

13 juin 2004

Mots clés : ultrasons focalisés, Paclitaxel, estramusine phosphate, tumeur Dunning, cancer de prostate.
Auteurs : PAPAREL P., CHAPELON J.Y., CURIEL L., RABILLOUD M., CHESNAIS S., GELET A.,
Référence : Prog Urol, 2004, 14, 40-46
Objectifs de l'étude :Démontrer une synergie d'action entre les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) et une chimiothérapie associant paclitaxel et estramustine-phosphate (EMP) sur un modèle de carcinome prostatique.
Matériel et méthodes : Le modèle animal est le rat Copenhague. Le modèle tumoral est un modèle d'adénocarcinome prostatique hormono-indépendant de la lignée Dunning R 3327-AT 2. La chimiothérapie est administrée chaque semaine pendant 4 semaines selon 2 modalités : soit à faible dose avec paclitaxel à 2 mg/kg/j 1 jour par semaine et EMP à 50 mg/kg/j 3 jours par semaine ; soit à forte dose avec paclitaxel à 3 mg/kg/j 1 jour par semaine et EMP à 75 mg/kg/j 3 jours par semaine. Le traitement par HIFU se fait à la deuxième semaine et seul 55% du volume tumoral est traité. L'étude comprend 42 rats répartis en 6 bras : Témoins, HIFU, paclitaxel-EMP à faible doses, paclitaxel-EMP à fortes doses, HIFU paclitaxel-EMP à faibles doses et HIFU paclitaxel-EMP à fortes doses. Les critères d'efficacité du traitement sont l'évolution du volume tumoral et la survie de l'animal.
Résultats : Après deux semaines de traitement, il existe une différence statistiquement significative entre les volumes tumoraux des différents bras de l'étude (p<0,0001). Les bras HIFU-chimiothérapie et à un moindre degré chimiothérapie seule ont les plus faibles progressions tumorales.
Conclusion : L'association HIFU/paclitaxel-EMP est plus efficace qu'un traitement par HIFU seul ou par paclitaxel-EMP seul sur la croissance des tumeurs Dunning dès les premières semaines de traitement.



Le traitement du cancer localisé de la prostate fait actuellement l'objet de nombreuses controverses. Cependant, il y a un consensus pour ne pas proposer de traitement chirurgical (prostatectomie radicale) aux patients dont l'espérance de vie est inférieure à 10 ans. Dans ces situations, d'autres options thérapeutiques sont possibles comme la radiothérapie, le traitement hormonal ou la surveillance simple.

Il existe un intérêt croissant pour les alternatives thérapeutiques non invasives telles que la brachythérapie, cryothérapie par voie percutanée ou encore le traitement par ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) [2, 17].

En 1992, Chapelon définit les paramètres nécessaires pour que les ultrasons puissent induire in-vivo des lésions tissulaires irréversibles par nécrose de coagulation [4]. Dans le même temps, ils démontrent que les ultrasons peuvent détruire l'adénocarcinome prostatique Dunning R 3327-AT 2 implanté sur le rat Copenhague et guérir la maladie cancéreuse [5]. Ce traitement n'entraïne pas de dissémination métastatique de la maladie chez ces rats traités. Au même moment, une étude conduite chez des chiens par Gelet a montré qu'il était possible d'induire des lésions de nécrose de coagulation au sein de la prostate en utilisant la voie transrectale sans risque pour le rectum [11].

Les premières études cliniques pour évaluer l'effet des HIFU sur le cancer localisé de la prostate de l'homme débutent en 1992. Des résultats préliminaires sont publiés en 96 et en 99 [7,10]. En 2000, Gelet publie une série de 82 patients qui ont bénéficié d'un traitement par HIFU [8]. Il s'agit de patients qui présentent un adénocarcinome de la prostate localisé (selon la classification TNM, il s'agit de stade T1 ou de stade T2) et qui ne sont pas candidats à un traitement chirurgical. Les résultats globaux montrent que le taux de survie globale sans progression est de 62% à 60 mois. Gelet a identifié les principaux facteurs influençant les résultats : les patients à haut risque (score de Gleason „ 8 et PSA „ 20) présentent un taux de survie sans progression de 42% versus 76% pour les patients à bas risque (Gleason _ 6 et PSA MATERIEL ET METHODES

Modèle animal et modèle tumoral

Le modèle animal est représenté par des rats mâles Copenhague âgés de 10 à 12 semaines.

Le modèle tumoral est un modèle d'adénocarcinome prostatique hormono-indépendant de la lignée Dunning R 3327 et de la sous lignée AT-2.

Lorsqu'un fragment tumoral est injecté sous la peau du rat, une énorme tumeur (plusieurs centimètres cube) se développe en position sous cutanée et le rat meurt en 8 semaines en l'absence de traitement. Le taux de métastases est de 30% (essentiellement métastases ganglionnaires).

Deux étapes sont nécessaires pour obtenir une population de 42 rats porteurs d'une tumeur sous-cutanée :

Etape 1 :

Des cellules tumorales Dunning R 3327, conservées dans de l'azote liquide sont d'abord décongelées, lavées puis injectées directement en sous-cutanée à trois rats dans trois secteurs différents de l'abdomen (l'injection d'un volume de 0,5 ml correspond à 10 millions de cellules). Neuf tumeurs d'environ 20 mm chacune se développent chez les trois rats deux semaines après l'injection.

Etape 2 :

Ces neuf tumeurs sont alors prélevées, lavées et pesées. On prépare ensuite des fragments tumoraux de 20 mg, qui seront implantés, sous anesthésie, de la même façon en sous-cutanée chez les séries de rats à étudier.

Les rats sont préalablement rasés au niveau de l'abdomen pour permettre un bon repérage du site d'implantation. Il est nécessaire que les fragments tumoraux administrés soient cubiques et le plus homogènes possible de manière à obtenir une tumeur deux semaines plus tard de forme sphérique régulière et non stellaire (ce qui rendrait les mesures plus délicates avec des risques accrus de biais). La tumeur atteint un volume moyen de 2,96 cc deux semaines après implantation (soit environ 20 mm de diamètre) et les différents traitements peuvent alors commencer.

Chimiothérapie

Deux agents chimiothérapiques seront utilisés dans notre étude :

- le paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers-Squibb) injection en sous-cutané [1]

- l'EMP (Estracyt, Pharmacia & Upjohn SA) en injection intrapéritonéale [12,16]

Ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU)

L'appareil qui délivre les ultrasons est composé de 3 éléments : un générateur d'ultrasons immergé dans un réservoir d'eau non ionisée et dégazéifiée, un écran permettant de visualiser des images échographiques, un ordinateur qui contrôle les déplacements de la tête de tir dans les 3 directions de l'espace.

Préparation de l'animal avant le traitement par HIFU

Avant le traitement, les rats sont anesthésiés avec un mélange kétamine (40 mg/kg) et xylazine (5 mg/kg) injecté par voie intrapéritonéale.

Chez le rat, une anesthésie correcte se caractérise par l'insensibilité au pincement d'une patte et l'abolition du réflexe d'occlusion palpébral lorsqu'on touche la cornée avec le doigt.

Le rat est ensuite placé en décubitus dorsal pour être rasé au niveau de la tumeur à l'aide d'une crème dépilatoire. Il est installé ensuite dans un sarcophage en plexiglas (Figure 1).

Figure 1 : Le rat est placé dans un sarcophage avant le traitement par HIFU. Une lacette en plastique est placée à la base de la tumeur pour tenter de la décoller le plus possible de la paroi abdominale.

Il est nécessaire de vérifier qu 'après la fermeture du sarcophage, le rat peut respirer normalement. Il faut pour cela mesurer sa fréquence respiratoire et vérifier qu'il n'y a pas de gêne lors de l'inspiration. Le corps du rat avec la tumeur est ensuite immergé dans un bain d'eau dégazéifiée préalablement chauffée à 37°C pour protéger le rat contre l'hypothermie. Le traitement par ultrasons peut alors commencer (Figure 2).

Figure 2 : Le rat est ensuite immergé dans un bac d'eau dégazéifiée et chauffée à 37°C pour être traité par les HIFU.

Caractéristiques du transducteur utilisé :

- Transducteur sphérique tronqué divisé en 8 anneaux

- Diamètre 50 mm

- Troncature : 31 mm

- Rayon de courbure : 45 mm

- Surface active : 1,388 x 10-3 m2

Paramètres de tir utilisés :

- Durée de tir : 5 s

- Repos entre tirs : 5 s

- Pas de tir : 1,6 mm

- Configuration de tir : spirale (Figure 3)

Figure 3 : Localisation et ordre des tirs en spirale au cours du traitement par HIFU.

Dans cette étude, le traitement par HIFU a pour objectif de traiter seulement la partie centrale de la tumeur. Pour cela, les paramètres de tir sont les suivants : 5x5 tirs avec une puissance acoustique de 13 W (21 W électriques) et une profondeur de tir de 15 mm.

Dimensions et configuration spatiale de la zone de nécrose intra tumorale calculées par ordinateur (Figure 4) :

Figure 4 : Aspect de la lésion au sein de la tumeur après traitement.

La largeur maximale de la lésion est de 16 mm. La lésion produite ne dépasse donc pas les limites de la tumeur. La lésion HIFU reste donc circonscrite à l'intérieur de la tumeur : 55% du volume tumoral est traité par HIFU (la zone traitée étant située au centre de la tumeur) et la partie périphérique de la tumeur (située en dehors de la zone de traitement HIFU) est traitée par la chimiothérapie systémique.

Dans les groupes comportant un traitement par HIFU, le tir sera réalisé le troisième jour de la première semaine de chimiothérapie.

Protocole expérimental

Après l'injection de cellules tumorales dans des rats donneurs, des fragments de 20 mg sont préparés et sont implantés à 42 rats répartis en 6 bras de 7 :

- le groupe 1 (n=7) est le groupe témoin

- le groupe 2 (n=7) reçoit le traitement par HIFU seul

- le groupe 3 (n=7) reçoit le paclitaxel et l'EMP à faibles doses

- le groupe 4 (n=7) reçoit le paclitaxel et l'EMP à fortes doses

- le groupe 5 (n=7) reçoit le paclitaxel et l'EMP à faibles doses associé aux HIFU

- le groupe 6 (n=7) reçoit le paclitaxel et l'EMP à fortes doses associé aux HIFU

Quinze jours après l'implantation du fragment tumoral, la tumeur a une taille d'environ 20 mm de diamètre.

Le protocole d'administration de la chimiothérapie est le suivant :

Le traitement va commencer deux semaines après l'implantation sous-cutanée de la tumeur. Le traitement dure 4 semaines (4 cycles d'une semaine). Un cycle se décompose de la manière suivante :

- lundi : EMP

- mardi : paclitaxel

- mercredi : +/- HIFU

- jeudi : EMP

- vendredi : pas de traitement

- samedi : EMP

- dimanche : pas de traitement

Les posologies des chimiothérapies administrées sont les suivantes:

- la chimiothérapie à fortes doses : EMP (75 mg/kg pendant 3 jours par semaine pendant 4 semaines) et paclitaxel (3 mg/kg/j administré le deuxième jour de la semaine pendant 4 semaines).

- la chimiothérapie à faibles doses : EMP (50 mg/kg pendant 3 jours par semaine pendant 4 semaines) et paclitaxel (2 mg/kg/j administré le deuxième jour de la semaine pendant 4 semaines).

Critères d'efficacité du traitement

Les critères d'efficacité sont l'évolution du volume tumoral et la survie de l'animal.

Les tumeurs sont photographiées de face et de profil chaque semaine à côté d'une règle qui permettra de les mesurer avec une précision de l'ordre du mm.

La formule utilisée pour calculer le volume tumoral est la suivante:

Longueur x largeur x hauteur x 0,5236 [1].

Les résultats sont exprimés en cm3.

Au cours de la surveillance de la croissance tumorale dans les semaines qui suivent le traitement, les rats seront sacrifiés si la tumeur dépasse 60 mm de diamètre ou si le volume tumoral est tel que les rats ne peuvent plus se déplacer.

Tests statistiques utilisés

La méthode statistique utilisée pour comparer les différents bras de l'étude repose sur le test de Kruskal-Wallis (test non paramétrique utilisé du fait des petits effectifs de chaque bras).

Résultats

Les volumes tumoraux moyens de chaque bras sont mesurés pendant 5 semaines après le début du traitement (soit 7 semaines après l'implantation sous-cutanée de la tumeur) et regroupés dans le Tableau I.

Les rapports moyens entre le volume tumoral mesuré chaque semaine sur le volume tumoral de référence avant traitement (c'est-à-dire 2 semaines après l'implantation sous-cutanée de la tumeur) sont regroupés dans le Tableau II.

Concernant ce paramètre, la Figure 5 regroupe tous les bras de l'étude et la Figure 6 ne comprend pas les témoins de manière à être plus discriminant sur les courbes entre les 5 bras restants.

Figure 5 : Evolution du rapport des volumes tumoraux par rapport au volume tumoral initial pour chaque bras de l'étude (seule la période J7 et J14 est statistiquement significative).
Figure 6 : Evolution du rapport des volumes tumoraux par rapport au volume tumoral initial pour chacun des bras de l'étude sauf le bras témoin (seule la période J7 et J14 est statistiquement significative).

Le Tableau III compare les rangs des rapports des volumes tumoraux (volume tumoral après deux semaines de traitement / volume tumoral de référence avant tout traitement) entre les 6 bras de l'étude.

Le volume tumoral de chaque rat obtenu après deux semaines de traitement (soit 4 semaines après l'implantation sous-cutanée de la tumeur) est divisé par le volume tumoral de référence avant tout traitement. On obtient donc pour chaque rat un rapport. Ces rapports sont ensuite classés du plus petit au plus grand. Ainsi, les rapports les plus faibles correspondent aux tumeurs ayant peu grossi et les rapports les plus élevés aux tumeurs ayant beaucoup grossi. Un rang moyen pour chaque bras est ensuite établi. Puis le test de Kruskal-Wallis recherche une différence statistiquement significative entre ces différents bras.

Le Tableau IV compare les rangs des rapports des volumes tumoraux (volume tumoral après deux semaines de traitement/volume tumoral de référence avant tout traitement) après regroupement des bras chimiothérapie (association des effectifs des bras chimiothérapie faibles doses et fortes doses) et des bras HIFU-chimiothérapie (association des effectifs des bras HIFU-chimiothérapie faibles et fortes doses). Il existe une différence statistiquement significative entre les bras témoins, chimiothérapie seule, HIFU seul et HIFU-chimiothérapie deux semaines après le début du traitement.

A partir de la troisième semaine de traitement, on constate de nombreux décès dans les bras qui comportent un traitement par chimiothérapie (75% des rats de ces bras). Les autopsies n'ont pas pu être réalisées pour des raisons techniques. A partir de cette période, les résultats ne sont plus interprétables sur le plan statistique. Les résultats sur la survie à moyen terme des animaux traités n'ont donc pas pu être évalués dans cette étude.

Discussion

L'intérêt de l'association entre les HIFU et la chimiothérapie a été étudié expérimentalement sur l'animal par de nombreuses équipes [6, 21, 23, 24]. Ces dernières ont montré que l'association HIFU et chimiothérapie donnait de meilleurs résultats en terme de progression de la maladie et de survie qu'un traitement par HIFU seul ou par chimiothérapie seule. Ainsi, Yang montre que l'association HIFU-doxorubicine hydrocloride donne de meilleurs résultats sur la survie que la doxorubicine seule sur l'hépatome 3924A implanté chez le rat [23]. Fry et Johnson rapportent les mêmes résultats sur un médulloblastome de hamster (le taux de guérison qui est de 29% chez les animaux traités par HIFU seul s'élève à 40% lorsque l'on associe la carmustine aux HIFU) [6]. Moore améliore la survie d'animaux porteurs d'un hépatome 3924A lorsqu'il ajoute au traitement par HIFU du cyclophosphamide [18]. Dans ces études, il y avait une augmentation de la survie des animaux dans le bras combinant HIFU-chimiothérapie par rapport au bras HIFU seul et au bras chimiothérapie seule. Pour Yang, cette synergie pourrait s'expliquer par une meilleure diffusion cellulaire de l'agent chimiothérapique grâce à une augmentation de la perméabilité membranaire induite par les HIFU [23]. Cette hypothèse semble confirmée par les travaux de Huber qui montrent que l'application des HIFU (in vitro et in vivo) sur des cellules tumorales Dunning R3327-AT 1 augmente la transfection de plasmides dans la cellule [13]. Prat a montré sur un modèle de carcinose péritonéale d'origine colique chez le rat que le traitement par ondes de choc permettait de diminuer la dose de chimiothérapie administrée et donc sa toxicité. En effet, les résultats sur la survie à trente jours sont identiques entre les deux bras suivants : fortes doses de 5-Fluorouracile et association ondes de choc-faibles doses de 5-Fluorouracile [21]. Dans ces deux bras, la cavité péritonéale était indemne de cellules tumorales à trente jours ce qui n'était pas le cas du bras ondes de choc seul (40% de guérison) et du bras 5-Fluorouracile à faible dose (0% de guérison). Cette étude montre l'intérêt d'associer des ondes de choc à la chimiothérapie sur les résultats carcinologiques. Il faut préciser que les HIFU représentent un autre type d'onde mécanique mais qui sont en plus capables d'élever la température du tissu. L'association HIFU-chimiothérapie n'avait jamais été étudiée sur le cancer de la prostate.

Dans notre étude, le choix de la chimiothérapie s'est porté sur l'association de deux molécules : le paclitaxel et l'estramustine phosphate (EMP). Le paclitaxel est issu de l'écorce de l'if du Pacifique (Taxus brevifolia) et appartient à la famille des taxanes. Il agit sur la réplication des cellules en se fixant sur les microtubules qu'il stabilise, empêchant ainsi leur réorganisation nécessaire au déroulement de la mitose. L'EMP est constitué d'une moutarde azotée et d'un estrogène dérivé du 17-b estradiol. C'est un agent alkylant ayant une efficacité limitée lorsqu'il est utilisé en monothérapie avec un taux de réponse d'environ 20%. De nombreuses études ont montré que l'EMP potentialisait l'activité antitumorale des taxanes (paclitaxel et docetaxel) grâce à leur action synergique sur les microtubules [20]. L'association des taxanes (paclitaxel et docetaxel) avec l'EMP a été utilisée dans de nombreux protocoles pour traiter les cancers de la prostate en échappement hormonal chez l'homme [12, 14, 20, 22]. Il faut préciser que le seul traitement qui a actuellement l'autorisation de mise sur le marché (AMM) pour traiter le cancer de prostate en échappement hormonal est l'association de la mitoxantrone avec la prednisone.

Dans notre étude, l'association HIFU-chimiothérapie est le traitement le plus efficace sur la progression du volume tumoral deux semaines après le début des traitements (soit quatre semaines après l'implantation sous-cutanée de la tumeur). Nos résultats sont statistiquement significatifs (p CONCLUSION

L'association HIFU- paclitaxel/EMP est plus efficace qu'un traitement par HIFU seul ou paclitaxel/EMP seul sur la tumeur Dunning R 3327-AT 2 implantée chez le rat Copenhague. Cette association semble réduire de manière significative la progression du volume tumoral dès les premières semaines de traitement.

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