PARTIE B. Chapitre VI. Marqueurs moléculaires du cancer infiltrant de la vessie.

25 mars 2003

Mots clés : Vessie, Cancer, carcinome urothélial, tumeurs infiltrantes, Marqueurs tumoraux, biologie moléculaire, cycle cellulaire, marqueurs moléculaires.
Auteurs : RIGAUD J., TIGUERT R., FRADET Y., ZERBIB M., BOUCHOT O.
Référence : Prog Urol, 2002, 12, 1057-1083
Cette revue de la littérature a montré qu'aucun marqueur tumoral, utilisé seul en pratique quotidienne, n'avait de réelle valeur prédictive dans le cancer infiltrant de vessie. Toutefois, ces études ont mis en évidence un ensemble de marqueurs et de sentiers moléculaires qui sont modulés dans le cancer infiltrant de la vessie. Les techniques modernes, comme le "DNA-arrays" ou le "tissue-arrays" permettant l'évaluation simultanée de l'état de l'ensemble de ces systèmes moléculaires, pourront, nous l'espérons, donner une signature ou une empreinte moléculaire du cancer par-delà les critères histopathologiques. Les voies de recherche les plus prometteuses semblent être l'étude des marqueurs sériques et, plus encore, la détection de cellules cancéreuses circulantes, comme moyen d'évaluer la probabilité de métastases systémiques et de prédire la réponse à la chimiothérapie.
Jusqu'à à ce jour, la recherche sur les marqueurs tumoraux a été le fait de chercheurs de laboratoire, testant la possibilité de prédire, plus précisément, le potentiel biologique du cancer et éventuellement l'évolution clinique. Il est essentiel maintenant que les cliniciens en fassent une priorité, puisque la pierre d'achoppement demeurera toujours l'existence de banques de tissus et/ou de sang provenant d'une grande cohorte de patients traités selon un protocole standardisé et suivis de façon rigoureuse. C'est là nous croyons le défi de la prochaine décennie de façon à ce que nos patients retirent les bénéfices des progrès technologiques réalisés en laboratoires.

I. INTRODUCTION.

Malgré les progrès dans les techniques chirurgicales et l'avènement de protocoles de chimiothérapie systémique démontrant une efficacité réelle, près de la moitié des patients traités pour cancer infiltrant de la vessie meurent de leur cancer souvent en quelques années seulement. Les paramètres cliniques existants ne permettent pas d'identifier avec assurance les patients qui ont été guéris par une chirurgie radicale de ceux qui pourraient bénéficier de traitement adjuvant. De la même manière il n'existe aucun moyen de prédire la réponse à la radiothérapie ou à la chimiothérapie néoadjuvante ou adjuvante sur la base des seuls critères pathologiques. Il y a donc un besoin réel de méthodes plus sophistiquées qui permettent de mieux évaluer le potentiel biologique de tumeurs individuelles afin d'ajuster le traitement le plus approprié pour un patient donné.

Les progrès dans notre compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la cancérogenèse offrent des opportunités réelles de caractériser les cancers à un niveau moléculaire, par delà l'aspect histologique. Les progrès technologiques permettent également des analyses extrêmement sophistiquées et à haut débit à partir d'échantillons cliniques rendant ainsi possible le rêve d'obtenir une signature moléculaire qui puisse identifier des cancers en apparence semblables à l'histologie mais distincts dans leur évolution clinique. L'objectif du présent chapitre est de revoir les progrès qui ont été faits dans l'analyse moléculaire des tumeurs vésicales, de déterminer l'état actuel de leur utilité clinique et de tracer des jalons qui nous croyons permettront de mener à l'élaboration de tests cliniquement utiles qui pourront guider la prise en charge des patients atteints de cancer infiltrant de la vessie. Le succès de cette approche doit passer impérativement par une concertation clinique et une synergie étroite entre les spécialistes des laboratoires, les médecins cliniciens traitants et les experts en bio-statistique. Nous espérons donc que cette revue et perspective saura susciter l'intérêt des cliniciens.

II. BREF HISTORIQUE.

La définition d'un marqueur tumoral est un paramètre moléculaire sur le tissu tumoral ou dans les liquides biologiques tels que le sang ou l'urine et qui puisse avoir une utilité clinique diagnostique ou pronostique de l'évolution de la maladie.

L'étude de marqueurs tumoraux du cancer vésical a débuté il y a un peu plus de vingt ans par l'analyse de l'expression des antigènes du groupe sanguin à l'aide d'une méthode d'adhérence de globules rouges de types sanguins différents sur les coupes tumorales. Dans les années 80, l'utilisation de la technique des hybridomes pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques a donné lieu à l'identification d'une gamme d'antigènes nouveaux qui ont été testés pour leur valeur diagnostique ou pronostique. Plusieurs de ces antigènes ont été par la suite reconnus comme des épitopes de groupes sanguins et ont donné des réactifs plus pratiques pour l'analyse histologique. D'autres antigènes du type mucine ou récepteur de surface ont été utilisés pour des tests diagnostiques du cancer vésical [26, 87]. La technique des anticorps monoclonaux a également permis d'identifier un marqueur pronostique du cancer infiltrant de la vessie, le T138, mais son utilité a été limitée par le fait que l'antigène ne peut être détecté que sur des coupes de tissu congelé [27, 113].

La découverte des oncogènes, également au début des années 80, a suscité beaucoup d'enthousiasme et l'espoir d'avoir enfin identifié la cause moléculaire du cancer. Bien que le premier oncogène décrit, l'oncogène H-ras, ait été d'abord étudié dans une lignée de cancer de la vessie, aucune utilité pronostique dans les cancers infiltrants n'a pu à ce jour être montrée. La recherche sur les oncogènes a permis d'identifier un ensemble de systèmes de signalisation intracellulaire en réponse à des récepteurs de surface et de mieux comprendre la complexité des mécanismes régissant l'interaction entre la cellule cancéreuse et son environnement.

En parallèle, les recherches en cytogénétique avaient identifié des pertes chromosomiques fréquentes dans les tumeurs solides et notamment les cancers de la vessie. L'arrivée de techniques moléculaires permettant d'étudier les délétions génétiques sur des échantillons tumoraux par comparaison aux cellules normales du même individu a propulsé la recherche de gènes suppresseurs des tumeurs au tout premier plan. Plutôt que l'acquisition ou la surexpression d'oncogènes, la perte de l'activité de gènes suppresseurs de la réplication cellulaire est devenue l'hypothèse primordiale de la cause des cancers, en particulier, les cancers solides dont celui de la vessie. Cette recherche a donné lieu à l'identification successive de gènes impliqués dans différentes étapes du contrôle de la division cellulaire qui au fur et à mesure de leur découverte ont été à tour de rôle évalués pour leur potentiel prédictif de la progression des cancers vésicaux. Les recherches moléculaires ont également identifié un ensemble de systèmes responsables de l'adhésion intercellulaire et de l'interaction entre la cellule cancéreuse et la matrice extracellulaire qui sont modulés par l'état cancéreux et fournissent d'autres marqueurs tumoraux potentiels. L'hypothèse que les cellules tumorales survivent en stimulant la formation de nouveaux vaisseaux pour les nourrir a donné lieu à une intense recherche sur les facteurs d'angiogenèse et les facteurs inhibiteurs de cette angiogenèse. Ce domaine de recherche extrêmement prolifique a permis d'identifier encore une autre avenue complexe qui puisse fournir des marqueurs pronostiques et également des avenues thérapeutiques. À cette enseigne l'analyse de marqueurs type cyclooxygenase (Cox-1 et 2) pourra éventuellement servir les mêmes fins.

Le tableau 1 résume très simplement l'ensemble des types de marqueurs tissulaires et des marqueurs sanguins qui ont été étudiés dans le cancer de la vessie et que nous reverrons brièvement dans ce chapitre. De loin, les plus étudiés sont les marqueurs du cycle cellulaire et leur contrepartie dans la mort cellulaire. Il devient évident que le comportement individuel des tumeurs est la résultante d'un ensemble de systèmes complexes. Les méthodes modernes de génomique et protéomique nous font miroiter la possibilité de vraiment déterminer la signature moléculaire des cellules cancéreuses en intégrant l'ensemble de cette information. Ces possibilités ainsi que les limites des études faites jusqu'à maintenant doivent stimuler une coordination des cliniciens pour la réalisation de banques tissulaires importantes obtenues dans un cadre de traitement clinique assez uniformisé et avec une rigueur dans le suivi clinique. La technique de "tissue-arrays" ou puce tissulaire va permettre l'étude à haut débit de milliers d'échantillons avec les marqueurs ou gammes de marqueurs jugés les plus prometteurs.

Quelques études récentes suggèrent également que la détection de certaines protéines dans le sérum et surtout la détection de cellules cancéreuses circulantes en utilisant les techniques de biologie moléculaire pourraient devenir un marqueur pronostique extrêmement utile pour évaluer les patients ayant une maladie microscopique résiduelle et voire même monitorer la réponse au traitement de chimiothérapie. Il y a donc eu des progrès énormes au cours des vingt dernières années qui ont été guidés principalement par l'avènement de nouvelles techniques performantes. Bien que les recherches jusqu'à maintenant ont permis d'accumuler une quantité importante d'information sur les molécules exprimées dans les cancers infiltrants de la vessie, elles ont permis de réaliser également l'importance d'études cliniques impliquant un très grand nombre de patients très bien caractérisés et les besoins urgents de collaborations multicentriques. Cet élément sera le fer de lance de tout progrès ultérieur au-delà des avancées technologiques.

III. CYCLE CELLULAIRE.

Le cancer se définit par une prolifération incontrôlée de cellules qui dans leur anarchie deviennent de plus en plus envahissantes au point de détruire l'équilibre cellulaire de l'hôte et éventuellement entraîner sa mort. Ce comportement des cellules cancéreuses est le résultat d'une instabilité génétique qui entraîne l'expression non coordonnée d'un nombre de gènes impliqués dans la reproduction cellulaire et dans l'interaction de cette cellule avec les autres cellules ou le tissu environnant. Ainsi, la cellule cancéreuse a perdu à des degrés divers la capacité de répondre aux facteurs inhibiteurs qui normalement règlent le taux de prolifération et le degré de différenciation des cellules. La compréhension des mécanismes qui contrôlent la reproduction cellulaire et des anomalies caractérisant l'état cancéreux a donc fait l'objet de recherches intenses qui ont permis de lever le voile sur un ensemble de sentiers moléculaires extrêmement complexes qui n'étaient pas suspectés il y a à peine une décennie.

Les premières observations sont d'abord venues par l'identification de la protéine p53 à l'aide d'anticorps polyclonaux et monoclonaux. Au tout début les chercheurs croyaient que la surexpression de cette protéine était le fait d'un oncogène hyper-activé. Cependant, les recherches ultérieures ont déterminé que cette surexpression protéique était due à des mutations du gène p53 entraînant la production d'une protéine anormale à demi-vie plus longue. La protéine p53 a été rapidement identifiée comme un élément clé dans les perturbations cancéreuses et a été même appelée "le gardien du génome". À l'état normal, cette protéine semble avoir la capacité d'induire l'arrêt du cycle cellulaire en cas de dommages de l'ADN. En parallèle, les recherches sur le rétinoblastome ont identifié un autre gène suppresseur appelé Rb qui s'est aussi avéré au centre du contrôle du cycle cellulaire. Les recherches sur les gènes suppresseurs ont permis d'identifier un ensemble d'autres protéines inhibitrices dénommées par leur taille moléculaire, p15, p16, p27, p21 et p19. L'ensemble de ces protéines inhibe des kinases dépendantes des cyclines (CDK4, CDK6 et CDK2) qui lorsque liées aux cyclines (cycline D, cycline E ou cycline A) activent ces dernières. Ces protéines jouent donc le rôle de frein à différents niveaux du cycle cellulaire (Figure 1).

Figue 1: Schéma des protéines régulatrices du cycle de division cellulaire ("flèche": stimule, "barre": inhibe, Rb: Rétinoblastome, Cyc: Cycline, CDK: Kinase dépendante des cyclines, TGFbeta: Transforming growth factor beta, MDM2: Murine double minute 2)

La figure 2 démontre schématiquement les différentes phases du cycle cellulaire. La phase G1 qui représente la phase de repos après la division peut être activée par le facteur E2F.

Figure 2: Implication des différentes cyclines dans le cycle cellulaire ( "flèche": stimule, "barre": inhibe, Rb: Rétinoblastome)

Ce facteur est libéré lorsque la protéine Rb (rétinoblastome) est phosphorylée par l'action de la cycline D complexée à la kinase CDK4 ou CDK6. La cycline D est activée directement par des facteurs mitogènes qui stimulent la cellule à se diviser. Ces facteurs mitogènes proviennent de l'environnement et peuvent représenter différents facteurs de croissance ou d'autres types de signaux intercellulaires. Les protéines p15 et p16 peuvent inhiber l'activation de la cycline D et réprimer la stimulation mitogénique.

Lorsque la cellule est stimulée par le facteur E2F elle passe un point de restriction et stimule la cycline E à enclencher la synthèse d'ADN qui mènera au doublement des chromosomes en phase G2 et à la mitose en phase M. La cycline A agit un peu plus loin dans la phase de synthèse pour entretenir ce cycle. La cycline E et la cycline A sont chacune inhibées par la protéine p27 et la protéine p21. Cette dernière est stimulée par la protéine p53 lorsque cette protéine est activée soit par un dommage dans l'ADN ou encore par un oncogène appelé MDM2. À l'état normal donc la cellule ne sera stimulée à la division que par des mitogènes et la cycline E ne sera activée qu'après la mise en route du cycle cellulaire par le gène Rb. Cependant, les cellules cancéreuses deviennent indépendantes des facteurs de croissance extracellulaires et on croit que ceci est dû à l'activation spontanée de la cycline E et/ou cycline A directement ou par perte d'inhibition par les protéines p27 ou p21. Le gène p53, lorsque activé par un bris de l'ADN, va enclencher les gènes de l'apoptose ou de la mort cellulaire qui est un phénomène de contrôle naturel dans l'équilibre des cellules.

Devant cette complexité du mécanisme de régulation de la division cellulaire il est clair que des anomalies à plusieurs niveaux peuvent entraîner une prolifération anormale. Il est aussi évident qu'une anomalie à un endroit de la chaîne peut entraîner une surexpression compensatrice à d'autres niveaux selon une logique de cybernétique cellulaire. Le cancer infiltrant de la vessie qui est généralement de haut grade est constitué de cellules dont l'instabilité génétique est extrême puisqu'elles sont fréquemment monstrueuses, aneuploïdes et très malignes. Il devient donc plus difficile d'identifier les anomalies moléculaires qui sont à l'origine de ce comportement plutôt que le résultat de cette anarchie. Les études faites jusqu'à maintenant ont porté sur un ou quelques marqueurs moléculaires individuels. Il n'est pas surprenant devant cette complexité que ces études n'aient pas donné de résultats probants. Par contre, les avancées technologiques plus récentes vont permettre d'évaluer en même temps la perturbation de l'ensemble de ces mécanismes moléculaires de façon à obtenir une image plus représentative de l'état de cette cellule. On peut donc espérer que ces signatures moléculaires seront des outils plus puissants pour distinguer des cellules au comportement biologique différent. Les études portant sur un ou plusieurs des marqueurs du cycle cellulaire nous permettent néanmoins d'identifier les marqueurs les plus souvent anormaux dans le cancer infiltrant de la vessie.

1. p53

La valeur prédictive de l'expression de la protéine p53 sur l'évolution du cancer de la vessie a fait l'objet de très nombreux travaux aux résultats parfois contradictoires (Tableau 2).

Tableau 2: Résultats de l'expression de p53 et sa valeur pronostique dans les tumeurs infiltrantes de la vessie (* tous les patients avaient des métastases ganglionnaires, -: non rapporté, Cystect: cystectomie radicale, Chimio: chimiothérapie, Radio: radiothérapie, NS: non significatif)

Plusieurs éléments peuvent expliquer ces différences. La protéine p53 détectée en immunohistochimie est une protéine mutée plus stable et ayant une demi-vie plus longue que la protéine "sauvage". Cependant toutes les mutations n'aboutissent pas à une stabilisation de la protéine. Par exemple, les mutations non-sens se traduiront souvent par une absence de la protéine, sachant aussi que toutes les mutations de la protéine p53 ne sont pas détectables par cette technique et par le même anticorps [40]. Lors des études immunohistochimiques, le marquage positif de la protéine p53 est le témoin le plus souvent d'une protéine mutée donc inactive, mais la protéine p53 peut aussi être non détectée lors d'étude immunohistologique (donc à priori normale) mais être en fait inactive car elle a perdu ses capacités fonctionnelles. Enfin la protéine p53 peut aussi être détectable dû à une sur-expression normale en réponse à des interactions des autres protéines du cycle cellulaire [105]. Il existe aussi des variations des protocoles d'immunohistochimie entre les équipes: utilisation de tissu fixé dans du formol ou du liquide de Bouin voire de tissu congelé, type d'anticorps différents pour la réaction, démasquage ou non des antigènes à l'aide d'un four micro-ondes, seuil de positivité du marquage différent [3]. Le Bladder Cancer Marker Network, a réalisé une étude sur la variabilité de l'expression de la protéine p53 par immunohistochimie entre différents laboratoires. La concordance a été très forte pour les cas franchement positifs ou négatifs, par contre il a existé une zone grise entre 1 % et 20 % où la variabilité inter-laboratoires a été très importante (Figure 3) [84].

Figure 3 : Variabilité du résultat immunohistochimique de l'expression de la protéine p53 réalisée par 5 différents laboratoires du Bladder Cancer Marker Network sur 50 tumeurs (10 de chaque institution). Pour chaque tumeur, 2 lames ont été envoyées à chaque laboratoire pour une coloration et une lecture puis elles ont été randomisées parmi les laboratoires pour une seconde lecture. Le pourcentage de concordance entre les deux lectures a été rapporté en fonction de l'expression de la protéine p53 (reproduit avec la permission de l'American Association for Cancer Research) [84].

Ces différences dans les cas frontières peuvent aussi expliquer les discordances entre les différentes études. Cependant les analyses immunohistochimiques restent tout de même hautement sensibles et spécifiques bien qu'un besoin de standardisation soit nécessaire afin de comparer les résultats des différentes études [120].

Schmitz-Dräger [120] a réalisé une revue de la littérature reprenant 138 études, comprenant 3764 patients, ayant analysé la valeur pronostique de la protéine p53 par étude immunohistochimique dans le cancer de la vessie. La sur-expression de la protéine p53 a été notée dans 36 % des cas en moyenne (3 à 78 %) dans le cancer superficiel, et dans 29 à 77 % des cas dans le cancer infiltrant. Cependant, il y a un grand nombre de variations entre les différentes séries en ce qui concerne l'anticorps utilisé (les clones DO-7 et PAb 1801 étant les plus utilisés) ou la valeur seuil de positivité de la réaction (Tableau 2). Dans la majorité des études incluant tous les stades du cancer de la vessie, la sur-expression de la protéine p53 semble être corrélée au stade pathologique et/ou au grade histologique [22, 36, 49, 75, 76, 93, 104, 140].

Des études ont rapporté une valeur pronostique de l'expression de la protéine p53 dans le cancer de la vessie traité par cystectomie. Par exemple, Esrig [22] a analysé 243 tumeurs de la vessie de stade pTa à pT4 traitées par cystectomie. La sur-expression de la protéine p53 a été associée à un risque plus élevé de récidive et une diminution de la survie globale en étude univariée. En étude multivariée, elle a été un facteur indépendant de la survie sans récidive ou de la survie globale. A l'opposé, Lipponen [75] a montré, sur une étude de 212 tumeurs, que la sur-expression de la protéine p53 a été un facteur prédictif de mauvais pronostic dans le cancer infiltrant en analyse univariée, par contre en analyse multivariée, elle n'a pas été un facteur indépendant sur la survie. De même Jahnson [49] n'a pas noté de corrélation entre l'expression de la protéine p53 et la survie spécifique chez 173 patients ayant une tumeur infiltrante de la vessie traitée par cystectomie. Le Bladder Cancer Marker Network [71] a aussi étudié 109 patients avec une tumeur infiltrante dont 57 ont évolué vers des métastases et 52 sans métastases à 5 ans. L'expression de la protéine p53 n'a eu aucune valeur pronostique sur la survie dans cette série. En résumé, autant l'expression de la protéine p53 a une valeur pronostique de progression des tumeurs superficielles à infiltrantes, aucune valeur prédictive indépendante de métastases ou décès n'a été clairement démontrée dans la majorité des études du cancer infiltrant de la vessie. Ces résultats non-concordants quant à la valeur pronostique de la protéine p53 comme seul marqueur pronostique dans les cancers infiltrants de la vessie, peuvent s'expliquer par la variabilité des techniques d'analyse et de taille des études.

2. CYCLINE E

La protéine Cycline E est une protéine du cycle cellulaire s'associant au groupe des kinases dépendantes des cyclines 2 (CdK2) pour former un complexe actif. Cette protéine activée participe à la transition du cycle cellulaire de la phase G1 à la phase S permettant ainsi la prolifération cellulaire.

Richter [116] a réalisé une étude par "tissue-arrays" sur 2317 échantillons provenant de 1842 patients ayant un cancer de la vessie tous stades confondus. Sur les 1873 tumeurs interprétables, la protéine Cycline E a été sur-exprimée dans 31,3 % des cas pour une valeur seuil > 20 %. Cette sur-expression a été statistiquement corrélée à un stade pathologique avancé (pT2-T4) et à un grade histologique élevé (grade 3). Tous stades confondus, la sur-expression de la protéine Cycline E a été associée à une survie spécifique plus longue. Par contre, pour les 565 cancers infiltrants (pT2-T4), elle n'a pas été un facteur pronostique sur la survie spécifique. Kamai [55] a étudié 145 cancers de la vessie comprenant 86 stades superficiels et 59 infiltrants. La sur-expression de la protéine Cycline E a été notée dans 73,8 % des cas pour une valeur seuil > 30 % et a été corrélée à un grade histologique élevé et un stade pathologique avancé. La sur-expression de la protéine Cycline E a eu une valeur pronostique sur la survie globale et la survie sans récidive. Makiyama [81] a réalisé une étude de l'expression de la protéine Cycline E sur des lames de sections complètes de 94 cancers de la vessie tout stade confondu. Ils ont noté que la sur-expression de la protéine Cycline E, dans 40,4 % des cas pour une valeur seuil > 20 %, a été corrélée avec un grade histologique élevé.

Del Pizzo [18] a réalisé aussi une étude de la protéine Cycline E sur 47 lames de sections complètes de tumeurs provenant de patients ayant un cancer de la vessie tous stades confondus. Par contre c'est la perte d'expression de la protéine Cycline E dans 72,3 % des cas pour une valeur seuil de 30 % qui a été corrélée à un grade histologique élevé et à un stade pathologique avancé. Avec une valeur seuil > 30 %, ils ont noté une survie globale prolongée chez les patients ayant une sur-expression de la protéine Cycline E.

3. p21

La protéine p21 est une protéine du groupe des inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines (CdKI) bloquant la progression du cycle cellulaire. Une fois activée, elle bloque la progression du cycle cellulaire en inhibant le complexe des CdK2 (Cycline E et Cycline A) bloquant ainsi la transition de la phase G1 à S du cycle cellulaire. L'action de la protéine p21 dans le cycle cellulaire est sous l'influence de la protéine p53. Cette intrication dans le cycle cellulaire permet d'expliquer certaines corrélations entre l'expression de ces deux protéines dans la carcinogenèse. Cependant l'expression de la protéine p21 peut aussi réguler le cycle cellulaire de manière indépendante de la protéine p53 [80]. La valeur pronostique de la protéine p21 dans le cancer de la vessie est controversée et les résultats des études sont différents entre le cancer superficiel et le cancer infiltrant. Son rôle n'est pas encore clairement défini pour une application concrète dans le cancer de la vessie.

Stein [129] a étudié 242 tumeurs provenant de patients ayant eu une cystectomie pour un cancer infiltrant de la vessie. Ils ont noté une sur-expression de la protéine p21 dans 64 % des cas pour une valeur seuil > 10 %. La sur-expression de la protéine p21 a été corrélée à un stade pathologique avancé ou un envahissement ganglionnaire mais pas au grade histologique. En étude univariée et multivariée, la sur-expression de la protéine p21 a été prédictive d'une diminution du risque de récidive tumorale et d'une augmentation de la survie globale. De plus, les patients ayant un phénotype p53+/p21- ont eu un taux de récidive plus élevé et une survie diminuée comparativement à ceux ayant un phénotype p53+/p21+. Cette différence en terme de survie entre les deux phénotypes a aussi été rapportée par Qureshi [111] lors d'une étude sur 68 tumeurs infiltrantes de la vessie mais traitées par radiothérapie externe exclusive. A l'opposé, Jahnson [49] a analysé 173 tumeurs infiltrantes de la vessie provenant de patients ayant eu une cystectomie. La protéine p21 a été sur-exprimée dans 51 % des cas pour une valeur seuil >= 10 %. L'expression de la protéine p21 n'a pas été statistiquement corrélée avec le sexe, l'âge, le stade clinique ou le grade histologique. De même elle n'a pas eu de valeur pronostique sur l'apparition d'une récidive ou la survie spécifique. Ils n'ont pas noté non plus de valeur pronostique sur la survie du phénotype p53+/p21-.

4. p27

La protéine p27 est une protéine du groupe des inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines (CdKI) bloquant la progression du cycle cellulaire. Comme la protéine p21, elle inhibe la progression du cycle cellulaire en inhibant le complexe des CdK2 (Cycline E et Cycline A) bloquant ainsi la transition de la phase G1 à S du cycle cellulaire. Par contre la protéine p27 n'est pas sous l'action de la protéine p53 mais elle est activée par des signaux extra-cellulaires comme le TGF-b ou des facteurs d'inhibition de contact.

L'implication et la valeur pronostique de la protéine p27 dans le cancer de la vessie sont controversées. Makiyama [81] n'a pas noté de corrélation entre l'expression de la protéine p27 et le grade histologique ou le stade pathologique. Par contre Del Pizzo [18], Kamai [55] et Korkolopoulou [61] ont montré qu'une sous-expression de la protéine p27 a été corrélée à un grade histologique élevé et un stade pathologique avancé ainsi qu'à une survie globale ou sans récidive diminuée. De plus, ils ont mis en évidence que la combinaison d'une diminution de l'expression de la protéine p27 et d'une sur-expression de la protéine Ki-67 a été le témoin d'une récidive plus précoce dans le cancer superficiel [55] et d'une survie globale plus courte dans le cancer infiltrant de la vessie [61]. Cependant ces études comprenaient à la fois des tumeurs superficielles et infiltrantes de la vessie, et surtout la valeur seuil pour définir une sur-expression de la protéine p27 a été variable avec des valeurs > 30 ou > 50 %.

5. RÉTINOBLASTOME (Rb)

Le gène Rb est situé sur le chromosome 13 et code pour une phosphoprotéine de poids moléculaire de 110 kD. Dans sa forme physiologique la protéine pRb a une action inhibitrice de la progression du cycle cellulaire au niveau du passage de la phase G1 à S. Néanmoins pRb subit des interactions des autres protéines régulatrices du cycle cellulaire comme les inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines (p21, p16, p27) qui a leurs tours désactivent les complexes CdK et ainsi inhibent la phosphorylation de pRb et la famille E2F qui jouent un rôle sur les gènes entrant en action dans la phase S du cycle cellulaire. La mutation du gène Rb a été découverte initialement dans les rétinoblastomes familiaux et sporadiques [69]. Les altérations du gène Rb peuvent être des mutations ou des anomalies d'expression de la phosphoprotéine non fonctionnelle (absence d'expression ou hyper-expression).

L'inactivation du gène Rb a été considérée comme une étape importante dans la progression des cancers de vessie. Plusieurs équipes ont rapporté que le taux d'altérations de Rb a été plus élevé dans les tumeurs de vessie de haut grade et de stade élevé. Cependant la perte de la fonction de Rb a eu un effet péjoratif sur la survie. Cordon-Cardo a rapporté que les patients ayant une tumeur infiltrante de la vessie n'exprimant pas la pRb ont eu une durée de survie plus courte que ceux dont les tumeurs ont exprimé une pRb normale [15]. De même Logothetis a démontré que l'altération de la protéine était plus fréquente dans les tumeurs avec un stade plus avancé et serait un facteur de mauvais pronostic [77].

Dans une étude rapportée par Cote [16] portant sur 185 patients traités par cystectomie radicale pour tumeur infiltrante de la vessie ou la stratification de l'expression de pRb a été faite en 3 groupes (négatif, pRb1+ 1-50%, pRb2+ plus de 50%), il en ressort que l'altération de pRb a été corrélé avec le stade pathologique avancé et le grade histologique élevé. Par ailleurs aucune différence de survie globale ou spécifique n'a été observée entre les patients ayant une tumeur pRb- ou pRb2+. Cependant le groupe pRb1+ a eu une meilleure survie que les 2 autres groupes. Les auteurs ont conclu que l'amplification du gène Rb pourrait résulter d'une absence de détection de la protéine pRb lors des analyses immunohistochimiques et/ou d'une altération de la capacité fonctionnelle de pRb.

6. MURINE DOUBLE MINUTE 2 (mdm2)

Le gène mdm2 est localisé sur le chromosome 12 et code pour une protéine nucléaire de poids moléculaire de 90 Kd [62]. Initialement mdm2 a été identifié comme un gène impliqué dans la carcinogenèse sur un modèle cellulaire de souris [23]. La protéine mdm2 est capable de former des complexes avec la protéine p53 inhibant ainsi son action. La formation de ces complexes conduit a la destruction de la protéine p53 sauvage (normale). La protéine mdm2 est activée par la protéine p53 dans une cinétique auto-régulatrice [53].

La sur-expression de mdm2 a été observée surtout dans les tumeurs de vessie de bas grade et de bas stade mais elle n'a pas été un facteur pronostique sur la survie en cas de tumeurs infiltrantes [72]. Jahnson a rapporté une série, avec un suivi minimum de 5 ans, de 173 patients traités par cystectomie radicale pour une tumeur infiltrante de la vessie dont 122 ont reçu de la radiothérapie néo-adjuvante [49]. Aucune différence sur la survie globale et la survie spécifique n'a été démontrée quand les patients ont été stratifiés en fonction de l'expression de mdm2.

7. MARQUEURS DE L'APOPTOSE CELLULAIRE

L'apoptose est la mort programmée de la cellule qui aboutit à une destruction cellulaire mais par un mécanisme complexe différent d'une mort cellulaire induit par le système de défense immunitaire de l'organisme. La protéine p53 joue aussi un rôle dans l'apoptose, en cas de dommage majeure de l'ADN la protéine p53 active le système bcl-2/bax pour aboutir ensuite à l'apoptose de la cellule plutôt qu'a un arrêt de la synthèse de l'ADN par la voie de p21.

Le système bcl-2/bax comprend la protéine bcl-2 qui est un oncogène en exerçant un contrôle négatif sur l'apoptose à l'inverse de bax qui est son antagoniste et qui exerce une action positive sur l'apoptose afin de détruire la cellule devenue tumorale. Gazzaniga [34] a étudié le rapport d'expression des gènes bcl-2/bax sur 32 tumeurs de bas grade. Ils ont conclu que les patients ayant une tumeur exprimant plus bcl-2 que bax ont eu une récidive tumorale plus précoce. A l'opposé Plastiras [106] a étudié 75 tumeurs de stade pT1G2/3 et pT2-4. Ils n'ont pas noté de valeur pronostique sur la survie en fonction de l'expression de bcl-2 dans la cohorte analysée.

Un autre complexe impliqué dans l'apoptose est Fas/Fas Ligand. Il s'agit de protéines transmembranaires membres de la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) qui une fois activées induisent l'apoptose de la cellule [52]. Lee a retrouvé une sur-expression de Fas/Fas ligand dans 92 % des cas sur une étude portant sur 37 tumeurs de la vessie [67]. De même ils ont rapporté dans une autre étude portant sur 43 tumeurs de vessie, des mutations de Fas/Fas Ligand dans 28 % des cas pouvant expliquer que des altérations de ce gène peuvent aboutir à une absence d'apoptose et donc à l'apparition de cellule tumorale [68].

IV. MARQUEURS ASSOCIÉS A LA PROLIFÉRATION CELLULAIRE

1. PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)

Le PCNA est une protéine nucléaire de poids moléculaire de 36 Kd sécrétée aussi bien par les cellules normales que par les cellules tumorales lors de la division cellulaire. Sa demi-vie est longue de l'ordre de 20 heures [10]. L'expression immunohistochimique du PCNA a été corrélée avec un stade avancé et un grade élevé. Le PCNA a été un facteur pronostique de la survie globale et sans progression dans 2 études comprenant 34 et 17 tumeurs infiltrantes [7, 41]. A l'opposé, Plastiras [106] a rapporté sur une série de 33 patients traités par cystectomie radicale pour tumeur infiltrante de la vessie que l'expression du PCNA n'a pas été prédictive de la survie spécifique et globale.

2. KI-67

L'anticorps monoclonal Ki67 a été décrit pour la première fois par Gerdes en 1983 [35]. Le Ki-67 est un marqueur qui permet d'apprécier le nombre de cellules en prolifération car il marque les cellules à travers tout leur cycle sauf pendant la phase G0.

Une étude de l'expression de Ki67 a été réalisée sur 109 patients ayant une tumeur de stade pathologique >pT2 traités par cystectomie dont 57 avec des métastases ganglionnaires. Il n'a pas existé de corrélation entre l'expression de Ki-67 et la présence de métastases ganglionnaires [71]. Par ailleurs dans une autre étude de 65 patients traités par cystectomie radicale pour tumeur infiltrante de la vessie, le pourcentage de marquage des tumeurs par Ki-67 a été corrélé avec le grade, le stade et la présence de métastases ganglionnaires. De plus l'expression de Ki-67 a été un facteur prédictif de la survie sans récidive en analyse univariée et multivariée [130].

V. FACTEURS DE CROISSANCE

1. LE RÉCEPTEUR À L'EPIDERMAL GROWTH FACTOR (EGF-R)

Le récepteur à l'Epidermal Growth Factor (EGF-R) est une glycoprotéine transmembranaire qui est activée par la liaison de l'Epidermal Growth Factor (EGF) et du Transforming Growth Factor-alpha (TGF-a) sur son domaine externe [2]. Cette activation conduit à la phosphorylation des tyrosines kinases intracellulaires qui déclenchent la prolifération cellulaire, leur transformation et leur division [82]. L'EGF-R peut être mis en évidence par plusieurs techniques comme l'immunohistochimie, le radio marquage et l'analyse par PCR [78, 95].

Les EGF-R sont retrouvés au niveau de plusieurs cellules y compris l'épithélium transitionnel. Sur le tissu sain, ils sont normalement distribués qu'au niveau des couches basales alors qu'ils se répartissent sur toutes les couches des tumeurs urothéliales [85, 96]. Cette observation supporte la notion d'augmentation des EGF-R en présence de tumeur de vessie. Dans les tumeurs de vessie, une corrélation entre la sur expression des EGF-R, le haut grade et le stade élevé a été observée [74]. Sur une étude de 43 patients traités par cystectomie radicale pour tumeur infiltrante de la vessie, l'expression d'EGF-R n'a pas eu d'impact sur la survie [114]. Sriplakich [128] a évalué l'expression d'EGF-R sur une série de 173 patients traités par cystectomie radicale dont 149 ont reçu de la radiothérapie néo-adjuvante a la chirurgie. Leurs résultats ont montré l'absence de corrélation entre l'expression d'EGF-R et la survie. Cependant, l'expression fréquente du récepteur EGF sur les tumeurs infiltrantes de la vessie suggère que des inhibiteurs de ce sentier de stimulation de la croissance cellulaire, tel que le OSI-774 et le ZD1839 (Iressa) pourraient avoir un effet anti-tumoral en adjuvant à la chimiothérapie systémique [12].

2. EPIDERMAL GROWTH FACTOR (EGF)

L'EGF est retrouvé sous sa forme active en grande concentration dans les urines. L'analyse des urines de rats sains a montré que EGF peut promouvoir la formation de cellules tumorales dans la vessie [139]. Les EGF isolés de l'urine humaine ont été capables de stimuler la croissance des lignées de cellules cancéreuses de vessie [64].

Les résultats rapportés sur EGF sont controversés. Mattila [83] n'a pas trouvé de différence de concentration d'EGF dans les urines de sujets sains et de ceux atteints de cancer de vessie. Alors que d'autres études ont rapporté que les concentrations urinaires d'EGF sont plus basses dans les cancers de vessie. Cette diminution d'expression d'EGF pourrait être due à l'occupation des récepteurs d'EGF (EGF-R) qui sont anormalement élevés. Néanmoins aucune corrélation entre l'expression d'EGF et le grade ou le stade des tumeurs de vessie n'a été démontrée par Fuse [31] ou par Ravery [114] qui ont analysé l'expression d'EGF sur 43 tissus de cancers infiltrants de la vessie de patients traités par cystectomie radicale.

3. TRANSFORMING GROWTH FACTOR-ALPHA (TGF-alpha)

L'expression de TGF-alpha déterminée par immunohistochimie a été plus élevée dans les tissus de cancer de vessie contrairement aux tissus sains. De même il a existé une corrélation entre les taux de TGF-alpha et ceux de EGF-R [86]. L'analyse immunohistochimique de 43 tumeurs infiltrantes de la vessie a montré une corrélation entre la survie spécifique et l'expression de TGF-alpha [114].

4. TRANSFORMING GROWTH FACTOR-BETA (TGF-beta)

Le TGF-beta stimule la prolifération des fibroblastes et des lymphoblastes mais inhibe la prolifération des lymphocytes, des cellules endothéliales et de la majorité des cellules épithéliales. TGF-beta a aussi une action angiogenique in vitro [57]. Les taux sanguins de TGF-beta sont élevés chez les patients atteints de cancer de vessie alors que les taux tissulaires sont plus élevés quand la tumeur est de bas grade et/ou de bas stade. Aucune corrélation entre les taux tissulaires et sanguins de TGF-beta n'a été démontrée chez les patients atteints de cancer de vessie [21].

VI. ANGIOGÉNÈSE.

L'angiogenèse est un processus complexe qui mène à la formation de nouveaux capillaires sanguins assurant ainsi une augmentation de l'apport nutritionnel et une expansion tissulaire. Une hypothèse prédominante veut que l'angiogenèse soit indispensable à la croissance des tumeurs solides et à la dissémination métastatique. La formation de néo-vaisseaux fait intervenir des mécanismes de régulation entre différents types de cellules capables de synthétiser des facteurs de croissance, des cytokines, des composants de la matrice extra-cellulaire (MEC) et des enzymes spécifiques [11]. Les médiateurs de l'angiogenèse identifiés dans le cancer de la vessie ont une action inhibitrice comme la thrombospondine-1, l'interleukine 12 et l'interféron g ou une action activatrice comme le basic et acide Fibroblast Growth Factors (bFGF et aFGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor beta1 et beta2 (TGF beta1 et beta2), Interleukine 8, et les enzymes dégradant la matrice extracellulaire [51]. Les marqueurs les plus étudiés dans le cancer de la vessie ont été la densité des micro-vaisseaux (DMV), le bFGF et le VEGF.

1. LA DENSITÉ DES MICRO-VAISSEAUX (DMV)

La densité des micro-vaisseaux (DMV) est appréciée par un marquage immunohistochimique des cellules endothéliales en utilisant des anticorps dirigés contre les antigènes spécifiques de l'endothélium: facteur VIII, CD31 ou CD34. Hawke et al [42] ont étudié la DMV en analysant le facteur VIII par immunohistochimie sur 42 pièces de cystectomies. La DMV a été associée à la survie en analyse univariée mais en analyse multivariée, elle n'a pas été significative. Par conséquent, les auteurs ont conclu que la DMV a peu d'intérêt en clinique comme facteur pronostique dans le cancer de la vessie. De même, Lianes et al [71] n'ont pas trouvé de différence du taux d'angiogenèse entre 57 tumeurs infiltrantes avec métastases ganglionnaires et 52 sans métastase. A l'opposé, Jaeger [48] a noté sur une série de 41 tumeurs infiltrantes de la vessie que la DMV, appréciée par le facteur VIII, a été corrélée à un risque de métastase ganglionnaire. De même Bochner [5] a étudié, sur 164 patients ayant une tumeur infiltrante de la vessie, la DMV par analyse immunohistochimique de CD34. Ils ont conclu que la DMV a été un facteur pronostique indépendant sur la survie globale et la survie sans récidive tout comme le grade histologique, le stade pathologique et l'envahissement ganglionnaire.

2. LE BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR (bFGF)

Le basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) est un inducteur de l'angiogenèse et possède une forte affinité pour l'héparine. Ce facteur de croissance est essentiellement stocké dans la matrice extra-cellulaire proche des membranes basales et est libéré en cas de dégradation de cette matrice. O'Brien [99] a montré sur une série de 83 échantillons d'urines que le taux de bFGF a été plus élevé chez les patients ayant un cancer de la vessie. De même Nguyen [97] a montré que le taux urinaire de bFGF a été plus élevé en cas de tumeurs vésicales métastatiques comparativement aux tumeurs localisées. Gazzaniga [33] a étudié l'expression de bFGF par analyse de l'ARNm sur 32 tumeurs de vessie. Ils ont montré que le taux de bFGF a été plus élevé dans les tumeurs invasives que les tumeurs superficielles. De plus, l'expression du bFGF a été corrélée à une survenue d'une récidive locale. Cependant l'utilisation du bFGF urinaire semble être limitée en clinique du fait du manque de spécificité dans les carcinomes urothéliaux. En effet, un taux élevé de bFGF peut être observé en présence d'une hypertrophie bénigne prostatique et d'autres tumeurs solides comme le rein [98, 99].

3. LA THROMBOSPONDINE-1

La thrombospondine-1 est une protéine qui possède une puissante activité anti-angiogenique. Le marquage immunohistochimique de la thrombospondine-1 est inversement corrélé à la DMV. La diminution de l'expression de cette protéine contribue donc à l'induction de l'angiogenèse et par conséquent son expression dans le tissu sain permet une certaine quiescente vis à vis d'une néo-vascularisation. Grossfeld [38] a étudié l'expression de la thrombospondine-1 et de la DMV sur 163 pièces de cystectomies. Ils ont conclu que la thrombospondine-1 possède une fonction inhibitrice de la croissance tumorale. De plus l'expression de la thrombospondine-1 a été corrélée à la progression tumorale et à la survie globale.

4. LE VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF)

Le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) est un facteur spécifique des cellules endothéliales qui agit par l'intermédiaire de récepteurs transmembranaires présents à la surface des cellules endothéliales. Il stimule la migration et la prolifération des cellules endothéliales et augmente la perméabilité vasculaire. Les quelques études faites sur l'expression du VEGF tissulaire ou urinaire ont toutes été dans les tumeurs superficielles où les résultats demeurent controversés et il n'existe aucune donnée à ce jour dans les cancers infiltrants de la vessie.

VII. LES MOLÉCULES D'ADHÉSION CELLULAIRE ET LA MATRICE EXTRA-CELLULAIRE.

Les molécules d'adhésion cellulaire jouent un rôle important dans les interactions inter-cellulaires et cellulaires avec les éléments de la matrice extra-cellulaire [13]. Plusieurs familles de molécules d'adhésion cellulaire ont été reconnues : les cadhérines, les sélectines, les intégrines et les molécules immunoglobuline-like d'adhésion cellulaire. Ces molécules sont impliquées dans un grand nombre de fonctions cellulaires : la transduction des signaux d'activation, la communication et la reconnaissance cellulaire, l'embryogenèse, l'inflammation, les réponses immunitaires et l'apoptose. La perte de l'adhésion inter-cellulaire peut conduire à la métastase de la cellule tumorale par voie sanguine ou par voie lymphatique. Il est probable que les molécules impliquées dans l'adhésion inter-cellulaire sont associées à l'invasion et au potentiel métastatique de la majorité des cancers humains y compris ceux de la vessie.

1. E-CADHÉRINE

Les cadhérines font partie de la famille des glycoprotéines transmembranaires et jouent un rôle très important dans les interactions inter-cellulaires. Chaque molécule de cadhérine se trouvant sur une cellule s'attache avec une autre identique se trouvant sur une autre cellule pour former un homo-dimère. Les cadhérines sont attachées entre elles par des liaisons homo-philiques et homo-typiques [132]. Le fonctionnement normal de ces cadhérines n'a lieu qu'en présence de calcium sinon elles sont rapidement dégradées par des protéases (Figure 4).

Figure 4: Interactions intra-cellulaires et inter-cellulaires avec les complexes des cadhérines

L'altération de l'expression des cadhérines est une étape nécessaire pour que les tumeurs puissent évoluer, car la perte transitoire ou permanente de la jonction inter-cellulaire est un pré requis pour qu'une tumeur puisse progresser localement et migrer à distance. Les cadhérines sont divisées en plusieurs classes qui partagent une structure de base commune formée du domaine extra-cellulaire, du domaine intra-cellulaire et de la chaîne transmembranaire. Quatre sous-classes de molécules cellulaires d'adhésion ont été individualisées : P (placenta), N (neurale), E (épithélial) et L-CAM (foie).

La perte de l'expression de E-cadhérine a été associée avec la progression et les métastases des cancers de la prostate et de la vessie [132]. L'expression de E-cadhérine appelée aussi (Arc-1, uvomoruline et Cell-Cam 120/80) a été anormalement diminuée dans plusieurs tumeurs solides, suggérant que E-cadhérine pourrait agir comme une molécule inhibitrice de la progression tumorale [28].

Les études de E-cadhérine dans les tumeurs de vessie ont rapporté que la diminution de son expression a été corrélée avec des tumeurs de haut grade et de haut stade. La première étude rapportée sur l'analyse de E-cadhérine dans les cancers de la vessie a analysé 49 tumeurs (24 superficielles et 25 infiltrantes). Elle a montré une corrélation entre la diminution de l'expression de E-cadhérine et les tumeurs de haut grade et de haut stade ainsi qu'une corrélation entre la perte d'expression et une diminution de survie [8]. Byrne [9] a analysé l'expression de E-cadhérine sur une série de 77 patients traités par cystectomie radicale dont 59 pour une tumeur infiltrante. La diminution d'expression de E-cadhérine a été corrélée avec la progression de la tumeur et la survie spécifique mais pas avec la survie globale. En analyse multivariée l'expression de E-cadhérine a eu une valeur pronostique sur la progression du cancer mais pas pour la mortalité spécifique par cancer de la vessie. Une étude sur une série de 68 patients dont 53 ayant une tumeur infiltrante de la vessie a montré une corrélation entre l'absence d'expression de E-cadhérine et le grade élevé et le stade avancé. E-cadhérine a aussi été associée avec une diminution de la survie globale [131]. Ce marqueur a donc un potentiel intéressant qui mériterait d'être confirmé par une étude à grande échelle avec une technique rigoureusement validée.

2. INTÉGRINES

Les intégrines sont des glycoprotéines transmembranaires de poids moléculaire de 100 à 140 kD. Elles sont composées d'hétéro-dimères faits de 15 chaînes alpha et 9 chaînes beta, d'où la formation d'une vaste variété d'intégrines. Les intégrines sont exprimées par chaque cellule et leur présence est importante pour le maintien de l'architecture tissulaire [20, 45]. Les intégrines les plus connues agissent comme récepteurs pour les protéines de la matrice extracellulaire et comprennent le collagène, la laminine, la vitrinectine, la thrombospondine, le facteur de Von Willebrand et la fibronectine [20]. La région responsable pour la liaison des substrats est formée par la séquence d'acides aminés d'arginine, de glycine et d'aspartate (RGD, Arg-Gly-Asp). Les intégrines peuvent engendrer des métastases tumorales à partir de RGD. Les intégrines qui portent la séquence RGD s'appellent les dis-intégrines et peuvent jouer un rôle thérapeutique pour prévenir la formation de nouvelles colonies tumorales par l'implantation des cellules circulantes [47].

Les études immunohistochimiques ont montré que l'épithélium vésical normal exprime les intégrines alpha3, alpha5, et beta4. Leur présence dans les membranes basales assure la perméabilité de la paroi vésicale [137]. Une étude immunohistochimique effectuée sur des lignées cellulaires normales et cancéreuses ainsi que sur des échantillons de tissus tumoraux a suggéré que la perte de l'expression de l'intégrine alpha2 et contrairement la surexpression alpha5 pourraient être associées à la progression des tumeurs vésicales infiltrantes [73].

3. LES MÉTALLOPROTÉINASES DE MATRICE (MMP)

Les métalloprotéinases de la matrice extra-cellulaire appartiennent à la famille des endopeptides qui renferment un métal (zinc). Leur fonction principale est la dégradation du milieu extra-cellulaire. Les plus étudiées dans les cancers de vessie sont les MMP-2 (gélatinase A) et MMP-9 (gélatinase B) qui agissent sur destruction du collagène type IV contenu dans les membranes basales. L'analyse de MMP-2 et de MMP-9 par zymmographie sur des échantillons urinaires de patients atteints de cancer de vessie a montré que leurs taux sont plus élevés dans les tumeurs de haut grade et de stade avancé [4, 125]. Grignon [37] a réalisé une étude évaluant l'expression de MMP-2 et MMP-9 par immunohistochimie sur des échantillons tissulaires provenant de 42 patients traités par cystectomie pour tumeur infiltrante de la vessie. Aucune corrélation entre le stade, le grade et la survie n'a été remarquée.

Les inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases de matrice (TIMP) ont été identifiés et l'augmentation de leur expression inhibe l'action des MMP en réduisant la progression et les métastases. Les TIMP peuvent être détectés dans les urines ou dans le sérum. L'augmentation des taux sériques de TIMP-1 et TIMP-2 a été corrélée avec le stade élevé de tumeur de vessie [94]. Sur une étude de 41 tumeurs vésicales, l'expression de MMP-2 et TIMP-2 a été plus élevée dans les tumeurs infiltrantes que dans les tumeurs superficielles. Ces résultats suggèrent que TIMP-2 puisse être une cible thérapeutique dans le cancer de la vessie infiltrant [56].

VIII. CYCLOOXYGÉNASE.

Les cyclooxygénases sont des enzymes qui catalysent et contrôlent la phase initiale de la formation des prostaglandines à partir de l'acide arachidonique. Les prostaglandines jouent un rôle dans le processus d'inflammation, dans les réponses immunitaires, dans l'ovulation, dans la mitogenèse et l'apoptose [136]. La cyclooxygénase-1 (Cox-1) est retrouvée à des taux stables au niveau de la majorité des tissus et joue un rôle dans le maintien et la stabilité de la fonction physiologique cellulaire. La cyclooxygénase-2 (Cox-2), qui n'est pas exprimé par les tissus normaux, a été le sujet de plusieurs études contrairement a Cox-1. L'hyper-expression de Cox-2 a été retrouvée dans plusieurs tumeurs solides (recto-coliques, poumons, et seins).

Dans une étude de 29 patients atteints de tumeur de vessie, l'expression de Cox-2 n'a pas été corrélée avec le stade et le grade. Il a été suggéré que Cox-2 serait induite à un stade précoce de la carcinogenèse [6]. Une autre étude rétrospective a analysé 60 patients traités par cystectomie radicale pour une tumeur infiltrante de la vessie (pT2 ou plus). Les auteurs ont retrouvé qu'en analyse multivariée seul le stade et non l'expression de Cox-2 a été corrélée à la survie [124].

Nous avons analysé l'expression de Cox-2 par immunohistochimie sur des tumeurs infiltrantes recueillies chez 172 patients traités par cystectomie radicale. L'intensité de l'immunomarquage a été corrélée avec le grade de la tumeur, le stade pathologique et la survie. La sur-expression de Cox-2 a été corrélée avec une meilleure survie spécifique (Figure 5) [134].

Figure 5: Survie spécifique de 172 patients traités par cystectomie radicale pour un cancer infiltrant de la vessie en fonction de l'expression de Cox-2 [134]

Au moins 2 hypothèses pourraient expliquer ces résultats : d'un côté l'expression de la cyclooxygénase est associée à des tumeurs moins agressives et plus différenciées, et de l'autre il serait possible que les tumeurs qui exprimaient des quantités élevées de cyclooxygénase auraient répondu au traitement anti-inflammatoire. La deuxième hypothèse est supportée par une étude récente effectuée sur des chiens atteints de cancer infiltrant de la vessie qui ont une grande similitude avec ceux des humains. Sur les 18 tumeurs infiltrantes 12 ont régressé après administration de Piroxicam qui est un inhibiteur de Cox-2 [89].

IX. MARQUEURS SANGUINS.

1. PROTÉINES SÉRIQUES

L'importance d'un test sanguin pour le diagnostic et le suivi de patients est très bien connu en urologie avec le test PSA. Plusieurs équipes ont tenté d'identifier des protéines sériques dont la concentration puisse refléter le stade de la tumeur et également la possibilité de persistance de micro-métastases. La concentration de laminine p1, mesurée par radio-immunoassay chez 38 patients a montré des taux significativement plus élevés chez les patients ayant un cancer de la vessie infiltrant la membrane basale (stade pT1 ou plus élevé) par rapport au niveau observé chez des témoins normaux. La sensibilité de la laminine p1 a été de 79% avec une spécificité de 97% pour identifier la présence d'une infiltration de la membrane basale et il n'y a eu aucune corrélation avec le grade histologique. De plus, des taux sériques de laminine p1 très élevés ont été associés avec un taux de récidive élevé par opposition aux patients dont le taux sérique était plus faible [91]. De même, le taux de cytokératine 18 sérique a été également évalué chez 38 patients ayant un cancer de la vessie tous stades confondus et 25 témoins normaux. Le taux de cytokératine 18 a été significativement élevé seulement chez les patients ayant un cancer de la vessie infiltrant et en particulier les stades pT3 et pT4 [112]. De façon semblable, le taux sérique de E-cadhérine soluble évalué chez 40 patients avec un cancer de la vessie (28 superficiels et 12 infiltrants) a montré une corrélation du niveau de la protéine avec le nombre de tumeurs, la récidive au contrôle cystoscopique et la progression de grade et de stade. Le taux sérique n'a pas été cependant corrélé avec le niveau d'expression de E-cadhérine sur le tissu tumoral.

Deux études ont évalué le taux circulant du Fas Ligand soluble. Misoutani [88] a étudié 163 patients porteurs de cancer de la vessie et ont observé une corrélation entre les niveaux sériques de Fas Ligand soluble (sFasL) avec la progression de la maladie et le grade élevé ainsi que la probabilité de récidive des tumeurs de stade pTa. Par contre, Perabo [103] a trouvé des taux très variables de sFasL qui n'ont eu aucune corrélation avec le stade du cancer de la vessie.

Enfin, Sharia [122] a évalué le taux sérique du Transforming Growth Factor-beta (TGFbeta) chez 51 patients qui ont subi une cystectomie radicale. Ils ont confirmé un taux élevé de TGF-beta sérique chez des patients porteurs d'un cancer de la vessie infiltrant avant une cystectomie et que ce taux a été plus élevé chez les patients ayant des métastases ganglionnaires lors de la chirurgie. De plus, le TGF-beta sérique semble être associé à un risque accru de récidive et de mortalité par cancer.

2. DÉTECTION DE CELLULES CANCÉREUSES CIRCULANTES

La possibilité que la présence de cellules cancéreuses dans la circulation sanguine reflète l'état métastatique a été un objet d'intérêt depuis plusieurs années. Desgrandchamps [19], utilisant une technique d'immunocytochimie sur les cellules sanguines obtenues après séparation sur gradient Ficoll a démontré que des cellules épithéliales circulantes n'ont été détectées que chez des patients ayant un cancer de la vessie métastatique. Ils n'ont noté aucun effet du stade ou du grade de la tumeur primaire ni de la chirurgie endoscopique ou de la cystectomie sur le taux de détection de cellules épithéliales. Bien que les auteurs aient conclu que la chirurgie représentait peu de risques de disséminer les cellules cancéreuses, il est clair que la technique d'immunocytochimie a une sensibilité relativement faible par comparaison aux techniques qui font appel à la biologie moléculaire et à l'amplification d'acide nucléique pour détecter des événements rares.

Au moins trois études ont évalué la détection de la cytokératine-20 par Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour détecter la présence de cellules épithéliales circulantes dans le sang et dans la moelle. Retz [115] a détecté une positivité chez 35% des 20 patients étudiés par aspiration de moelle osseuse alors que seulement 2 des 20 patients ont eu une positivité dans le sang veineux. Fujii [29] utilisant une technique semblable a démontré un signal détecté chez 5/6 (83%) des patients ayant des métastases, 4/21 (19%) des patients ayant une tumeur localement avancée et 0/13 patients avec tumeurs superficielles ainsi que 0/25 volontaires normaux. Gudemann [39] a étudié 49 patients avec une technique semblable et ont observé une fréquence de positivité de 0% dans les stades T1 et de 63% dans les stades pT4.

Lu [79] a évalué un autre marqueur spécifique de l'urothélium, l'uroplakine II en RT-PCR. Ils ont trouvé une association de positivité avec la présence de métastases dans 75% des cas et 40% des stades pT2 et pT4 mais 4/14 (29%) des tumeurs de stade pTa ou pT1. Par contre, sur des tests sanguins séquentiels en cours de chimiothérapie, ils ont démontré la disparition de la positivité des cellules circulantes chez les patients répondeurs à la chimiothérapie systémique.

Gazzaniga [32] a comparé l'utilisation de l'uroplakine II et de cytokératine-20 à la mesure de EGF-R par RT-PCR chez 27 patients ayant un cancer de la vessie et 30 volontaires ainsi que 9 patients avec une cystite. Ils ont conclu que l'utilisation de la cible EGF-R a donné une positivité dans 74% des patients comparée à 15% pour la cytokératine-20 et 37% pour l'uroplakine II. Il est clair sur l'ensemble de ces études que la détection de cellules circulantes par technique d'amplification à l'acide nucléique est une technique très prometteuse pour évaluer la progression du cancer de la vessie, possiblement la persistance de métastases et monitorer la réponse à la chimiothérapie systémique. Toutefois, ces techniques sont complexes et nécessiteront une standardisation des tests et une bonne reproductibilité avant qu'elles puissent être utilisées à grande échelle.

X. MARQUEURS EN RÉPONSE À LA RADIOTHÉRAPIE OU LA CHIMIOTHÉRAPIE.

La valeur pronostique des marqueurs tumoraux a été étudiée dans les cancers infiltrants de la vessie chez des patients traités par radiothérapie ou chimiothérapie. La protéine p53 a été le marqueur le plus fréquemment étudié et sa valeur pronostique reste encore controversée et est variable en fonction de la chronologie des traitements (adjuvant ou néo-adjuvant).

1. RADIOTHÉRAPIE EXCLUSIVE

Osen [102] a étudié l'expression des protéines p53, Ki-67 et p21 sur 131 tumeurs infiltrantes de la vessie traitées par une radiothérapie externe exclusive. L'expression des protéines p53, Ki-67 et p21 n'a pas été corrélée au stade pathologique, et seul l'expression de la protéine Ki-67 a été corrélée au grade histologique. En analyse multivariée, le stade pathologique, le grade histologique et seulement la sur-expression de p21 ont été des facteurs pronostiques de la survie.

Qureshi [111] n'a pas montré de valeur pronostique de l'expression de la protéine p53 ou p21 sur la survie de 68 patients traités par radiothérapie exclusive pour un cancer de la vessie. Par contre l'association des deux marqueurs a été un facteur pronostique. En effet les patients ayant le phénotype p53+/p21+ ont eu une meilleure survie que ceux ayant un phénotype p53+/p21-. Ces résultats sont semblables à ceux de Stein chez les patients traités par cystectomie [129].

Moonen [90] a étudié 83 patients traités par radiothérapie exclusive pour un cancer de la vessie. Ils ont analysé l'index d'apoptose, l'expression des protéines Ki-67, p53, Cycline D1 et Rétinoblastome (pRb) en fonction de la survie et du contrôle local. En analyse multivariée, la sur-expression de la protéine p53, un index d'apoptose élevé et un grade histologique faible ont été des facteurs de bon pronostic sur le contrôle local de la tumeur. Cependant aucun de ces marqueurs n'a eu une valeur pronostique sur la survie globale ou la survie spécifique.

Ong [101], reprenant la même série que Moonen [90], a montré que la sur-expression de la protéine p53 ou de Bcl-2 a été corrélée à une diminution de la survie sans récidive et de la survie spécifique chez 83 patients traités par radiothérapie exclusive pour un cancer de la vessie. La combinaison du marquage positif de ces deux protéines a été un facteur indépendant sur la survie et sur le contrôle local en analyse multivariée en plus du grade histologique.

Jahnson [50] a étudié 154 tumeurs provenant de patients traités par radiothérapie exclusive pour un cancer de la vessie. Les protéines p53 et Rétinoblastome (pRb) ont été sur-exprimées dans 18 % et 42 % des cas respectivement. La sur-expression de la protéine p53 a été corrélée à un grade histologique élevé. Par contre l'expression de p53 ou pRb n'a pas eu de valeur prédictive sur la réponse au traitement, le contrôle local ou la survie spécifique.

Lara [66] a étudié la valeur pronostique de la protéine Ki-67 sur 55 tumeurs provenant de patients traités par radiothérapie externe exclusive pour un cancer infiltrant de la vessie. Une sur-expression de la protéine Ki-67 a été associée au grade histologique. La sur-expression de la protéine Ki-67 n'a pas été un facteur pronostique sur le contrôle local de la tumeur si la valeur seuil a été la médiane. Par contre, si la valeur seuil a été de 27 %, il a été noté un meilleur contrôle local sur les tumeurs sur-exprimant la protéine Ki-67. Sur la même série de tumeurs, un index d'apoptose faible avant le traitement par radiothérapie a aussi été un facteur prédictif du contrôle tumoral local et de la survie. En étude multivariée, le stade pathologique et l'index d'apoptose avant la radiothérapie ont été des facteurs de bon pronostic indépendants sur le contrôle local et la survie globale [65]. La sur-expression de p21 et un index d'apoptose élevé semblent être des facteurs de bon pronostic chez les patients traités par radiothérapie exclusive pour un cancer infiltrant de la vessie. La valeur pronostique de la protéine p53 ne semble pas clairement définie, mais son association à la protéine p21 permet de définir des phénotypes tumoraux ayant le meilleur pronostic (p53+/p21+).

2. RADIOTHÉRAPIE NÉO-ADJUVANTE À LA CYSTECTOMIE

L'équipe du département de Radiothérapie de Houston a étudié 109 patients traités par radiothérapie néoadjuvante 4 à 6 semaines avant la cystectomie. Ils n'ont pas noté de corrélation de l'expression de la protéine p53 avec la survie sans métastase la survie sans récidive ou la survie globale pour l'ensemble de la population. Par contre, l'expression de la protéine p53 a été un facteur prédictif indépendant de la survie globale dans le sous-groupe de patients ayant une tumeur de stade T3b [138]. L'expression de la protéine Rétinoblastome (pRb) n'a pas été corrélée à la survie globale, la survie sans métastase ou le contrôle local sur l'ensemble de la population. Par contre, pour le groupe de patients ayant une tumeur de stade T3b, la perte d'expression de pRb a été corrélée à une meilleure survie sans métastases et une survie globale mais pas à un meilleur contrôle local [107]. L'expression de la protéine bcl-2 n'a pas été corrélée à la survie sans métastases ou la survie globale mais une sous-expression de cette protéine a été le témoin d'un meilleur contrôle local de la tumeur en analyse multivariée. De plus l'association d'une sur-expression de la protéine bcl-2 et d'une sur-expression de la protéine pRb a été le témoin d'une mauvaise réponse à la radiothérapie [108].

Rotterud [118] a étudié l'expression de la protéine p53, mdm2 et p21 chez 59 patients ayant une tumeur stade T2-T4a de la vessie traitée par radiothérapie pré-opératoire à la cystectomie. La sur-expression de la protéine p53 a été un bon facteur pronostique sur la survie globale et la survie sans récidive. Par contre l'expression de mdm2 et de p21 n'a pas permis de prédire la réponse à la radiothérapie.

Ogura [100] a étudié 60 tumeurs infiltrantes de la vessie traitées par une radiothérapie néo-adjuvante à la cystectomie radicale. L'expression de la protéine p53 et de l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) sur les biopsie pré-radiothérapie a été corrélée à la radiosensibilité, déterminée par l'examen histopathologique de la pièce de cystectomie après la radiothérapie. L'expression de la protéine p53 n'a pas permis de prédire la radiosensibilité de la tumeur. Par contre l'expression de la PCNA a été corrélée à la réponse à la radiothérapie. La sur-expression de p53 semble être un facteur de bon pronostic sur la réponse et la survie chez les patients recevant une radiothérapie néo-adjuvante à la cystectomie pour un cancer infiltrant de la vessie.

3. CHIMIOTHÉRAPIE NÉO-ADJUVANTE À LA CYSTECTOMIE.

Sarki [119]at étudié 111 patients qui ont reçu un traitement néo-adjuvant par MVAC (Méthotrexate, Vinblastine, Doxorubicine et Cisplatine) pour un cancer infiltrant de la vessie. La sur-expression de la protéine p53 a été un facteur indépendant de mauvais pronostic sur la survie spécifique et la survie globale prédominant pour les tumeurs de stade pT2 et pT3a. Ainsi, à la lumière de ces résultats, l'équipe du Memorial Sloan-Kettering de New York a débuté une étude prospective où les patients ayant une tumeur p53 négative sont traités par chimiothérapie néoadjuvante et radiothérapie de consolidation pour sauver la vessie.

Kakehi [54] a étudié 60 patients traités par chimiothérapie à base de Cisplatine pour un cancer de la vessie, répartis en deux groupes. Le groupe 1 comprenait 32 patients traités par chimiothérapie néo-adjuvante à la cystectomie et le groupe 2, 28 patients traités par chimiothérapie pour des métastases à distance ou une tumeur loco-régionale inopérable. La sur-expression de la protéine p53 a été un facteur prédictif d'une survie spécifique diminuée dans le groupe 1, par contre dans le groupe 2 elle n'a pas été corrélée à la survie.

Inoue [46] a étudié la valeur pronostique de l'expression de bFGF (facteur de croissance des fibroblastes), VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire) et IL-8 (Interleukine 8) par hybridation in situ ainsi que la densité des micro-vaisseaux (MVD) par immunohistochimie avant et après la chimiothérapie sur 55 tumeurs provenant de patients traités par chimiothérapie MVAC (Méthotrexate, Vinblastine, Doxorubicine et Cisplatine) néo-adjuvante à la cystectomie radicale pour un cancer infiltrant de la vessie. En analyse univariée, les sur-expressions de VEGF et de MVD sur les biopsies avant la chimiothérapie ont été des facteurs de mauvais pronostique sur la survie sans récidive. En analyse multivariée, seule l'expression de VEGF a été un facteur indépendant. Par contre, sur les pièces de cystectomies après la chimiothérapie, les sur-expressions de bFGF et de MVD ont été des facteurs pronostiques indépendants d'une diminution de la survie sans récidive. Slaton et al [127] ont étudié l'expression des protéines E-cadhérine et matrice metalloprotéinase-9 (MMP-9) sur la même série de patients. Le rapport MMP-9/E-Cadherine > 1,8 a été un facteur pronostic indépendant de la survie sans progression. La sur-expression de p53 semble être un facteur de mauvais pronostic sur la survie globale et spécifique chez les patients recevant une chimiothérapie (à base de Cisplatine) néo-adjuvante à la cystectomie pour un cancer infiltrant de la vessie. De même la sur-expression de marqueur de l'angiogénèse comme MVD ou VEGF ont été des facteurs de mauvais pronostique sur la survie.

4. CHIMIOTHÉRAPIE ADJUVANTE À LA CYSTECTOMIE

Sengelov [121] a analysé 50 patients traités par chimiothérapie à base de Cisplatine et Méthotrexate pour l'apparition de métastases secondaires à un cancer de la vessie. L'expression de la protéine p53 sur la tumeur initiale n'a pas été prédictive de la réponse à ce traitement.

Qureshi [110] a analysé l'expression de p53 sur la réponse au traitement et la survie chez 83 patients ayant un cancer infiltrant de la vessie non-métastatique traité par résection trans-urétrale et chimiothérapie systémique à base de Cisplatine suivi de résection itérative. L'expression de la protéine p53 n'a pas été un facteur prédictif de la survie ou de la réponse à la chimiothérapie pour l'ensemble de la population. Cependant, dans le groupe des patients chimio-résistants, la sur-expression de la protéine p53 a été un facteur de bon pronostic sur la survie.

Cote [17] a réalisé une étude chez 91 patients traités par cystectomie radicale pour un cancer infiltrant de la vessie et randomisés ensuite vers une chimiothérapie adjuvante ou une surveillance simple sans chimiothérapie. 88 des 91 patients ont eu une analyse immunohistochimique de la protéine p53 sur le tissu tumoral provenant de la pièce de cystectomie. Ils ont mis en évidence que les patients ayant une tumeur p53+ ont eu une meilleure sensibilité et donc une meilleure réponse à la chimiothérapie adjuvante. De plus ils ont montré que les patients ayant une tumeur p53- et recevant une chimiothérapie adjuvante n'ont eu aucun bénéfice en terme de récidive ou de survie. Ces résultats ont servi de base à une étude randomisée multicentrique actuellement en cours où les patients ayant subi une cystectomie et dont la tumeur est localisée (pT1 ou pT2), sont testés pour l'expression de p53. Les patients ayant une tumeur p53+ sont randomisés à recevoir une chimiothérapie adjuvante versus une observation sans traitement.

Nous avons réalisé une étude sur 52 patients traités par cystectomie radicale au CHUQ-L'Hôtel-Dieu de Québec pour un cancer infiltrant de la vessie avec des métastases ganglionnaires et traités ou non par chimiothérapie adjuvante. La sur-expression de p53 dans le tissu tumoral a été corrélée à une meilleure réponse à la chimiothérapie [134], cependant la perte d'expression de p27 était un facteur pronostic de réponse beaucoup plus marqué.

Siu [126] a étudié l'expression des protéines p53, métallothionéine (MT), P-glycoprotéine et MIB-1 sur 118 tumeurs provenant de patients traités par chimiothérapie exclusive à base de Cisplatine pour un cancer de vessie métastatique ou localement avancé. La sur-expression de MT a été un facteur de mauvais pronostique sur la réponse à la chimiothérapie en analyse univariée et multivariée. Par contre, aucun des marqueurs n'a eu une valeur prédictive sur la survie pour l'ensemble de la population. Mais pour le sous-groupe de patients présentant des métastases, seule la sur-expression de MT a été associée à une survie plus courte. Ces études suggèrent que le phénotype p53 et possiblement p27 pourraient être des marqueurs prédictifs d'une bonne réponse à la chimiothérapie adjuvante de type MVAC, mais cette approche devra être confirmée dans des études rigoureuses.

5. RADIO-CHIMIOTHÉRAPIE EXCLUSIVE

Cooke [14] a étudié l'expression de bcl-2 et p53 sur 51 tumeurs provenant de patients traités par radiothérapie associée ou non à une chimiothérapie néo-adjuvante par Cisplatine pour un cancer infiltrant de la vessie. Les auteurs ont conclu que les patients bénéficiant au mieux de la chimiothérapie néo-adjuvante à la radiothérapie ont été ceux dont la tumeur montrait peu d'expression de la protéine bcl-2.

Rodel [117] a analysé l'expression de l'index d'apoptose, p53, Ki-67 et bcl-2 sur 70 tumeurs provenant de patients traités par résection trans-urétrale et radio-chimiothérapie pour un cancer infiltrant de la vessie. Une sur-expression de Ki-67 et un index d'apoptose élevé ont été des facteurs de bon pronostic sur le contrôle tumoral local et la survie spécifique. L'expression de marqueurs de prolifération cellulaire (index d'apoptose et Ki-67) ou d'apoptose (bcl-2) semble aider à sélectionner au mieux les patients pour une chimiothérapie néo-adjuvante à la radiothérapie.

XI. NOUVEAUX OUTILS DE RECHERCHE SUR LES MARQUEURS TISSULAIRES.

À la lumière des résultats revus dans ce chapitre, il est clair que l'analyse de la valeur pronostique des marqueurs tumoraux dans le cancer infiltrant de la vessie a été limitée d'une part par les facteurs de reproductibilité technique inter-laboratoire qui n'ont jamais été bien mis au point et également par la taille relativement restreinte des cohortes de patients étudiées. De plus, la multiplicité des sentiers moléculaires perturbés dans le cancer infiltrant de la vessie rend très difficile l'identification d'un ou de quelques marqueurs pronostiques étant donné l'instabilité génétique extrême de ces tumeurs malignes. Un élément de solution peut être fourni par les techniques modernes de DNA-arrays et de protéomique couplées à des approches d'analyses mathématiques nouvelles. De plus, la transposition du concept DNA-arrays à la formation de banques tissulaires par "tissue-arrays" est également un progrès significatif qui devrait permettre d'identifier plus facilement la valeur pronostique de marqueurs potentiels sur une grande cohorte de patients bien caractérisés.

1. DNA-ARRAYS

La technique du DNA-arrays consiste à mettre en évidence l'expression de différents gènes dans les tissus afin d'établir des profils d'expression géniques. Pour ce faire, on dispose de "puces" contenant de l'ADN ou des oligonucléotides (courte séquence d'ADN) que l'on fait réagir par hybridation avec le tissu à analyser. Ces puces peuvent contenir certains gènes spécifiques de la recherche envisagée mais peuvent aussi contenir l'ensemble des gènes jusqu'alors connu.

Le principe consiste dans un premier temps à extraire l'ARN messager du tissu à analyser puis à synthétiser de l'ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse en marquant cet ADNc par un fluorochrome. Lors d'analyse de profils géniques de cancers où l'on cherche à démontrer des changements d'expressions géniques entre le tissu normal et le tissu tumoral, on marque les deux ADNc par deux fluorochromes différents bleu et rouge par exemple afin de reconnaître les ADNc qui se sont hybridés. De telles analyses permettent d'établir des modifications d'expression génique dans le tissu tumoral par rapport au tissu normal.

Les ADNc ainsi marqués sont ensuite hybridés avec les puces d'ADN connu. La puce est interprétée à l'aide d'un microscope à fluorescence et de logiciels informatiques qui déterminent pour chaque séquence d'ADN de la puce représentant un gène le ratio et l'intensité entre les deux fluorochromes. On obtient ainsi le patron d'expression génique de chaque tissu et par des techniques complexes de bio-statistique ont peut déduire les modifications d'expression des gènes dans le tissu tumorale par une analyse de type "grappes" ou "clusters".

2. TISSUE-ARRAYS

Kononen [59] a développé la technique de "tissue-arrays" ou "tissue-microarrays" selon le principe du "DNA-arrays". Elle consiste à l'aide d'un appareil (le "tissue-arrayer") à prélever des carottes biopsiques de 0,6mm de diamètre ou plus d'un bloc de tissu fixé en s'aidant d'une lame d'hématoxyline et éosine pour délimiter les zones tumorales (Figure 6), pour ensuite les déposer dans un bloc de paraffine vierge créant ainsi le bloc de "tissue-arrays" (Figure 7).

Figure 6: Prélèvement d'une carotte dans le bloc donneur en repérant la zone tumorale grâce à une lame d'hématoxyline et éosine délimitant la zone tumorale
Figure 7: Dépôt de la carotte tumorale dans le bloc receveur qui deviendra ainsi le bloc final de "tissue-arrays"

Jusqu'à 1000 échantillons différents peuvent ainsi être inclus dans un même bloc de paraffine bien qu'en pratique les blocs contiennent entre 400 et 800 spécimens. Il est possible de réaliser jusqu'à 500 lames de sections de 5 mm d'épaisseur par bloc qui sont ensuite utilisées pour des analyses in situ comme l'immunohistochimie (IHC), l'hybridation in situ de l'ARN messager (ISH) ou l'hybridation in situ par fluorescence (FISH) [43, 44, 59]. Toujours selon le même principe, il est possible aussi de créer des blocs de "tissue-arrays" (appelé "cryo-arrays") à partir de tissu congelé dans l'OCT et déposé dans un bloc receveur d'OCT [24]. L'avantage du "cryo-arrays" est de pouvoir réaliser des études sur l'ARN et l'ADN de meilleure qualité que le "tissue-arrays" car il y a moins de dégradation de ces molécules dans l'OCT que dans le tissu fixé enrobé de paraffine.

La technique de "tissue-arrays" permet d'analyser simultanément et rapidement un grand nombre d'échantillons en standardisant les manipulations afin d'étudier l'implication de nouveaux marqueurs ou de marqueurs déjà existants dans l'évolution des pathologies. Elle permet aussi de simplifier des collaborations entre les différents laboratoires en diminuant la quantité d'échantillons échangés amenant à des études sur un plus grand nombre de cas, augmentant ainsi la véracité des résultats.

Nous avons réalisé au centre de recherche du CHUQ-L'Hôtel-Dieu de Québec une étude consistant à valider cette technique de "tissue-arrays" dans le cancer infiltrant de la vessie. Nous avons inclus 236 échantillons provenant de différentes tumeurs infiltrantes de la vessie (stade pT2 ou plus) sous forme de blocs de "tissue-arrays" en prélevant un minimum de 4 carottes de 0,6mm de diamètre par échantillon (Figure 8). Ensuite nous avons comparé l'expression de différents marqueurs tumoraux du cycle cellulaire (Cycline E, p53, p21et p27) entre des lames de sections complètes de tissu et des lames de "tissue-arrays" provenant des mêmes échantillons (Figure 9). De même, l'expression de ces 4 marqueurs a été analysée en fonction des données clinico-pathologiques, de la survie globale et de la survie sans récidive en tenant compte du résultat obtenu sur les lames de sections complètes de tissu et les lames de "tissue-arrays".

Figure 8: Coloration d'hématoxyline et éosine d'une lame complète de "tissue-arrays"
Figure 9 a,b,c: Marquage immunohistochimique de carottes de "tissue arrays" à un grossissement x 25. ( A: marquage de p53 à 0%, B: marquage de Cycline à 30%, C: marquage de p21 à 100% )

Dans notre étude, le pourcentage de carottes non-interprétables a été en moyenne sur les 4 marqueurs de 22,9 % du fait principalement d'une absence de tissu tumoral sur la carotte plus que d'une absence totale de tissu (carotte décollée). Cependant le nombre de patients non-informatifs (aucune carotte interprétable) n'a représenté en moyenne que 3,2 % des cas.

Les résultats des analyses immunohistochimiques ont montré une concordance moyenne de 96,0 %, 94,4 %, 88,2 % et 90,8 % de l'expression des protéines Cycline E, p53, p21, p27 respectivement, entre les lames de sections complètes de tissu et les lames de "tissue-arrays" provenant des mêmes échantillons (Figure 10).

Figure 10: Fréquence et pourcentage de concordance de l'expression positive ou négative des différents marqueurs entre le résultat obtenu sur les lames de sections complètes et les lames de "tissue-arrays". Le pourcentage de concordance est le rapport du nombre de cas ayant une bonne concordance sur le nombre de cas interprétable (nombre total de cas moins les cas non-informatifs)

Les cas de discordances ont été attribués principalement (73,1 % en moyenne sur les 4 marqueurs) à un aspect hétérogène de la tumeur sur les lames de sections complètes. Les analyses statistiques de l'expression des protéines Cycline E, p53 et p27 avec les données clinico-pathologiques n'ont pas montré de différence en fonction des résultats obtenus sur les lames de sections complètes de tissu ou sur les lames de "tissue-arrays". Une différence des analyses statistiques entre ces deux techniques a été mise en évidence uniquement pour la corrélation de p21 avec les données clinico-pathologiques mais il est à noter que la concordance de p21 entre les lames de sections complètes et les lames de "tissue-arrays" n'a été que de 88,2 %. Par contre les différences statistiques de la survie globale et sans récidive ont été similaires selon les résultats obtenus par les deux techniques. La technique de "tissue-arrays" est donc une technique fiable dans certaines limites qui permet une analyse rapide des marqueurs tumoraux sans modifier de manière importante les analyses statistiques qui en découle. Elle permet aussi une uniformité de la technique de coloration immunohistochimique, réduisant ainsi les variations possibles entre les lots d'échantillons en fonction des jours où ils ont été techniqués et tout ceci avec une moindre quantité de produit réactif donc avec un coût plus faible.

Dans notre étude, les protéines Cycline E, p53, p21 et p27 ont été sur-exprimées dans 46,0 %, 32,9 %, 54,1 % et 30,7 % des cas respectivement sur les lames de "tissue-arrays". La sur-expression de la protéine Cycline E a été corrélée à un grade histologique avancé et à un carcinome in situ associé à la tumeur infiltrante. La sur-expression de la protéine p53 a été corrélée à un grade histologique avancé et à une absence d'antécédents d'instillation intra-vésicale de BCG avant la cystectomie. La protéine p21 n'a pas été statistiquement corrélée à un facteur clinico-pathologique en prenant les résultats obtenus sur les lames de "tissue-arrays" (elle a été corrélée à un stade pathologique avancé sur les lames de sections complètes). La sur-expression de p27 a été corrélée uniquement avec le sexe masculin. Cependant aucun de ces 4 marqueurs n'a eu une valeur pronostique statistiquement significative sur la survie globale ou la survie sans récidive dans notre étude (Figure 11 et 12).

Figure 11 a,b: Survie des patients en fonction de l'expression de la protéine p53 obtenu sur les lames de "tissue arrays". ( A: survie globale, B: survie sans récidive )
Figure 12 a,b: Survie des patients en fonction de l'expresion de la protéine p21 obtenu sur les lames de "tissue arrays". ( A: survie globale, B: survie sans récidive )

CONCLUSION.

Cette revue de la littérature a montré qu'aucun marqueur tumoral, utilisé seul en pratique quotidienne, n'avait de réelle valeur prédictive dans le cancer infiltrant de vessie. Toutefois, ces études ont mis en évidence un ensemble de marqueurs et de sentiers moléculaires qui sont modulés dans le cancer infiltrant de la vessie. Les techniques modernes, comme le "DNA-arrays" ou le "tissue-arrays" permettant l'évaluation simultanée de l'état de l'ensemble de ces systèmes moléculaires, pourront, nous l'espérons, donner une signature ou une empreinte moléculaire du cancer par-delà les critères histopathologiques. Les voies de recherche les plus prometteuses semblent être l'étude des marqueurs sériques et, plus encore, la détection de cellules cancéreuses circulantes, comme moyen d'évaluer la probabilité de métastases systémiques et de prédire la réponse à la chimiothérapie.

Jusqu'à à ce jour, la recherche sur les marqueurs tumoraux a été le fait de chercheurs de laboratoire, testant la possibilité de prédire, plus précisément, le potentiel biologique du cancer et éventuellement l'évolution clinique. Il est essentiel maintenant que les cliniciens en fassent une priorité, puisque la pierre d'achoppement demeurera toujours l'existence de banques de tissus et/ou de sang provenant d'une grande cohorte de patients traités selon un protocole standardisé et suivis de façon rigoureuse. C'est là nous croyons le défi de la prochaine décennie de façon à ce que nos patients retirent les bénéfices des progrès technologiques réalisés en laboratoires.

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