Mécanismes de résistance à la castration : l’hypoxie intratumorale stimule l’expression du récepteur aux androgènes

25 mars 2016

Auteurs : P. Lunardi, J.-B. Beauval, M. Roumiguié, M. Soulié, O. Cuvillier, B. Malavaud
Référence : Prog Urol, 2016, 3, 26, 159-167
But

L’expression des gènes dépendant de l’hypoxie contrôle l’adaptation du microenvironnement à l’initiation, la promotion et la progression tumorale. L’objectif de l’étude était d’observer l’influence de l’hypoxie sur l’expression du récepteur aux androgènes (RA), à l’aide d’un modèle original de sphéroïdes multicellulaires obtenus à partir de cellules tumorales prostatiques hormono-indépendantes.

Matériel

Deux lignées cellulaires d’adénocarcinome prostatique de faible sensibilité aux androgènes ont été utilisées afin de générer des sphéroïdes tumoraux multicellulaires (STM). Les conditions et la durée d’incubation conditionnaient la taille définitive des STM et le gradient d’hypoxie intrinsèque. L’expression du RA était étudiée par immunohistochimie (IHC) et la sécrétion de PSA dosée dans le milieu de culture.

Résultats

Le marquage IHC du RA était caractérisé par un gradient décroissant de la périphérie vers le centre des STM (moins intense en zone centrale hypoxique), correspondant à une translocation nucléaire du RA activé. Ce gradient était d’autant plus marqué que la durée d’incubation en milieu hypoxique était prolongée. L’hypoxie entraînait une augmentation significative de l’expression du RA à 6h de privation d’oxygène. Cette activation du RA était corrélée à une augmentation de l’activité transcriptionnelle des gènes cibles, avec notamment une sécrétion accrue de PSA.

Conclusion

Cette démonstration de l’activation, de l’augmentation d’expression et de l’activité transcriptionnelle du récepteur aux androgènes par l’hypoxie est la première à avoir été faite avec un modèle original d’hypoxie plus proche de la réalité que les modèles précédents, c’est-à-dire proche de l’hypoxie tissulaire observée dans les tumeurs primitives.

Niveau de preuve

4.




 




Introduction


Le concept de cancer de prostate résistant à la castration (CPRC) a aujourd'hui supplanté celui d'hormono-résistance car il a été observé, dans les conditions de suppression androgénique, que l'activité des récepteurs aux androgènes (RA) persiste ou est réactivée. Plusieurs travaux mesurant l'activité du RA ou l'expression d'enzymes impliquées dans les voies de la synthèse des androgènes ont permis de mettre en évidence divers mécanismes moléculaires pouvant expliquer la réactivation du RA dans le CPRC [1, 2].


L'hypoxie est caractéristique des tumeurs solides, et ses conséquences (expression des gènes dépendant de l'hypoxie) contrôlent l'adaptation du microenvironnement à l'initiation, la promotion et la progression tumorale [3, 4]. Il est actuellement établi que les facteurs clefs de l'adaptation au stress hypoxique sont les facteurs de transcription inductibles par l'hypoxie ou Hypoxia Inductible Factors (HIF) [5, 6]. Le facteur HIF-1α est surexprimé dans de nombreux cancers : la prolifération rapide des cellules tumorales et la mauvaise architecture du système vasculaire tumoral entraînent la formation de zones hypoxiques au sein de la tumeur permettant la stabilisation des sous-unités α. Cette surexpression est corrélée à un mauvais pronostic et à un échec de la radio- et chimiothérapie [7].


Un des effets les plus précoces de la privation d'androgènes s'observe au niveau des capillaires prostatiques entraînant de manière très rapide une hypoxie par diminution du débit sanguin au niveau local [8]. Cependant, au-delà d'une période variable de privation androgénique, on assiste à une diminution de l'hypoxie locale due à une néo-angiogenèse elle-même médiée par l'hypoxie [9]. En effet, au niveau prostatique, l'hypoxie entraîne une stabilisation de HIF-1 qui peut alors se lier à l'élément de réponse à l'hypoxie (HRE) situé sur les gènes cibles inductibles par l'hypoxie, entraînant l'activation transcriptionnelle de ces derniers [10] : on assiste alors à une synthèse de vascular endothelial growth factor (VEGF) ainsi qu'une augmentation de l'activité transcriptionnelle du RA, d'autant plus importante qu'elle est suivie in vitro d'une ré-oxygénation mimant la néo-angiogenèse [11]. Mitani et al. [12] ont démontré sur un modèle 2D qu'à une faible concentration de DHT mimant le stade de résistance à la castration, l'hypoxie augmente la transactivation ligand dépendant du RA via HIF-1. Cependant, ces travaux portent sur l'étude de lignées cellulaires tumorales en monocouche, c'est-à-dire dans des conditions de croissance sensiblement différentes de la croissance tissulaire.


L'objectif de l'étude était d'observer l'influence de l'hypoxie sur l'expression du RA sur un modèle 3D plus proche de la réalité, en se servant du modèle original des sphéroïdes tumoraux multicellulaires (STM) obtenus à partir de cellules tumorales prostatiques immortalisées.


Matériel et méthodes


Cultures cellulaires et génération des sphéroïdes


Les lignées humaines d'adénocarcinome prostatique 22Rv1 (société ATCC, Molsheim, France) et C4-2B (société Viromed Laboratories, Minnetonka, États-Unis), par ordre décroissant de sensibilité aux androgènes, étaient utilisées. Les lignées cellulaires étaient cultivées en milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institut medium, Lonza) supplémenté à 10 % de SVF (sérum de veau fÅ“tal, Gibco) dans des flasques de 75cm3 (Corning).


Pour générer des sphéroïdes, les cellules cultivées en monocouche étaient détachées par protéolyse à la trypsine afin de générer une suspension de cellules isolées, et réparties dans des puits individuels sur des plaques de 96 puits (1000 cellules par puits, dans un volume de 100μl). La formation des sphéroïdes était alors initiée par centrifugation des plaques à 1200rotation par minute (rpm) pendant 6min. Cette méthode permettait d'obtenir dans chaque puits un sphéroïde dont la variation de taille était quasiment nulle. Les plaques étaient enfin incubées dans des conditions de culture standard à 37°C, 5 % de CO2 dans des incubateurs humidifiés, en milieu RPMI pendant 7 et 14jours afin d'obtenir des sphéroïdes d'environ 400 et 900 microns (±10 %) respectivement.


Conditions expérimentales 2D


Les conditions expérimentales de culture cellulaire monocouche étaient réalisées par ensemencement de plaques de 10cm de diamètre. Lors du passage des cellules, on réalisait un comptage cellulaire sur lame de Neubauer après récupération du contenu des flasques afin d'ensemencer les plaques dans du milieu RPMI supplémenté en SVF. Vingt-quatre heures après, on réalisait alors 2 conditions expérimentales pour chaque lignée :

culture dans une chambre à hypoxie (0,01 % O2 , 5 % CO2 , 37°C) pendant 6heures (2 plaques par lignée) et 24heures (2 plaques par lignée) ;
contrôle normoxique avec culture en milieu standard à 6 et 24heures.


Les cellules étaient grattées, centrifugées à 400g pendant 3 min à 4°C, puis les culots congelés immédiatement pour analyse ultérieure par western blot de l'expression protéique de HIF-1α et RA.


Conditions expérimentales 3D


Les plaques de sphéroïdes étaient cultivées en normoxie ou en hypoxie :

culture en normoxie des sphéroïdes récupérés et fixés à J7 et J14 ;
culture en hypoxie de sphéroïdes à J7 de leur croissance pendant 30 min, 3heures, 8heures et 24heures avant récupération et fixation.


Avant la récupération, chaque sphéroïde était incubé 2heures à 37°C avec du pimonidazole (Hypoxyprobe®), une sonde chimique se fixant de manière préférentielle au niveau des zones hypoxiques. Les sphéroïdes générés et mis en culture étaient prélevés à la pipette dans chaque puits aux différents temps précédemment décrits. Après lavage, la procédure différait selon la technique d'analyse IHC ultérieure : fixation à la formaline (Sigma) pendant 2h à 4°C pour cryosection (5μm), ou fixation au paraformaldéhyde (PFA, Sigma) pendant 1h30 à 4°C, pour mise en paraffine et réalisation de coupes de 3 à 5μm étalées sur lame de verre.


Afin de réaliser les marquages immunohistochimiques (IHC), les coupes de sphéroïdes étalées sur lames étaient réhydratées 30 min dans du PBS 1X, post-fixées 20 min à la formaline, lavées à nouveau 15 min au PBS 1X, bouillies 30 min au tampon citrate 10 mmol/L (pH6) si la restitution d'antigénicité était nécessaire, pré-incubées dans une solution de blocage (BSA 1 % et Triton 0,5 % dans PBS 1X) pendant 45 min, incubées avec l'anticorps primaire pour la nuit puis avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure, et enfin incubées au DAPI 0,1μg/ml pendant 10 min (marquage des noyaux) avant montage sur lame. Les lames étaient traitées avec différents fluorochromes et anticorps primaires afin d'étudier par immunofluorescence : DAPI (ADN cellulaire), anticorps anti-PARP clivée (apoptose), anticorps anti-Ki67 (prolifération), anticorps anti-pimonidazole (Hypoxyprobe®), anticorps anti-RA (récepteur aux androgènes). Les lames ont enfin été observées au microscope optique classique (Tableau 1).


Dosage du PSA sécrété par les sphéroïdes


Au moment de la récupération des sphéroïdes à J7 de leur croissance après culture en normoxie ou en hypoxie, le liquide surnageant était prélevé dans chacun des puits (100μL par puits). Le surnageant de 20 sphéroïdes était additionné afin d'obtenir une quantité de liquide suffisant (2mL) pour réaliser un dosage du PSA sur automate, puis congelé avant analyse.


Critères d'évaluation


L'existence d'une hypoxie intrinsèque au sein des sphéroïdes les plus volumineux a été évaluée par l'existence d'un gradient de marquage entre le centre et la périphérie, c'est-à-dire une fixation plus importante des marqueurs d'hypoxie et d'apoptose au centre du sphéroïde et au contraire une fixation plus importante des marqueurs de prolifération cellulaire en périphérie. Les expériences IHC ont cherché à mettre en évidence une corrélation entre l'hypoxie et l'expression du RA en observant les concordances de localisation des marquages aux anticorps. L'anticorps anti-RA utilisé était dirigé contre un épitope situé sur la zone de changement conformationnelle du RA lorsqu'il est activé et transloqué dans le noyau. Lorsqu'un marquage différentiel était retrouvé, un démasquage des antigènes était réalisé afin d'affirmer que la disparition du marquage était bien due à une modification de conformation du RA. Des expériences de mise en hypoxie de sphéroïdes intrinsèquement non hypoxiques ont été réalisées pour recréer artificiellement ces résultats, et observer l'effet de la durée de mise en hypoxie sur la modification du marquage (utilisation du logiciel NDP View, mesurant l'épaisseur moyenne de la zone marquée dans une série de sphéroïdes placés dans les même conditions). De la même façon, l'influence de la durée d'hypoxie sur l'expression de la quantité de protéines RA a été évaluée par western blot , ainsi que la sécrétion de PSA dans le surnageant.


Analyse statistique


La significativité statistique des résultats a été évaluée grâce au test de Student. La significativité a été admise lorsque p <0,05, et les calculs ont été réalisés à l'aide du logiciel Prism (GraphPad).


Résultats


Résultats immunohistochimiques (IHC)


Les sphéroïdes étaient sortis de leur milieu de culture et mis en lame à J7 et J14 afin d'obtenir 2 groupes de taille différente : environ 400μm pour les J7, et environ 900μm pour les J14. Pour les sphéroïdes à J7, il n'existait pas de gradient de prolifération ou d'apoptose : le marquage PARPc (apoptose) et pimonidazole (hypoxie) étaient nuls, tandis que le marquage KI67 (prolifération) était homogène. Pour les sphéroïdes à J14, les marquages ont permis de mettre en évidence un gradient de prolifération avec le KI67, ainsi qu'un gradient d'apoptose avec PARP clivée (Figure 1). Ce gradient de prolifération et d'apoptose était corrélé à une moindre disponibilité en oxygène au centre des sphéroïdes, de manière intrinsèque lorsque la taille de ceux-ci dépasse les 500μm environ. Ainsi les marquages d'apoptose par PARP clivée et d'hypoxie par pimonidazole étaient superposables au centre du sphéroïde (Figure 2).


Figure 1
Figure 1. 

Coupes de sphéroïdes C4-2B à J7 (à gauche) et J14 (à droite) : marquage de prolifération (Ki67). J7 (400μm) : grossissement 20×. A. Marquage DAPI (noyaux). B. Marquage de prolifération (Ki67). C. Fusion des images. J14 (900μm) : grossissement 10×. D. Marquage DAPI (noyaux). E. Marquage de prolifération. F. Fusion des images.




Figure 2
Figure 2. 

Coupes de sphéroïdes à J14 issus des lignées 22rv1 (à gauche) et C4-2B (à droite). A. Marquage DAPI. B. Marquage des zones hypoxiques par le pimonidazole (vert). C. Marquage des zones apoptotiques avec PARP clivée (rouge). Grossissement 10×.




Il existait au sein des sphéroïdes une corrélation inverse observée entre marquage du RA et hypoxie. Pour les sphéroïdes à J7 (<500μm, sans gradient d'hypoxie), un marquage homogène par l'anticorps anti-RA était retrouvé dans le sphéroïde. Il n'existait pas de gradient de marquage d'hypoxie, de prolifération, d'apoptose ou de RA, quel que soit le type cellulaire, pour une taille de 400 microns (résultats non présentés). À l'inverse pour les sphéroïdes à J14 (>750μm), un gradient de marquage décroissant de la périphérie vers le centre a été établi pour l'expression du RA, moins intense en zone centrale hypoxique (Figure 3). Le marquage redevenait homogène après démasquage des antigènes (échantillons bouillis dans du tampon citrate pH6 pendant 30 min) qui en déstructurant les protéines de leur conformation 3D rendait à nouveau accessible aux anticorps des épitopes masqués jusqu'alors (Figure 4).


Figure 3
Figure 3. 

Coupes de sphéroïde C4-2B à J14 sans démasquage des antigènes. A. DAPI (bleu). B. Hypoxie (vert). C. RA (rouge). D. Fusion des images B et C. Grossissement 10×.




Figure 4
Figure 4. 

Coupes de sphéroïdes C4-2B à J14 avec démasquage des antigènes. A. DAPI (bleu). B. Hypoxie (vert). C. RA (rouge). Grossissement 10×.




Les sphéroïdes à J7 (non hypoxiques) étaient ensuite placés dans une enceinte à hypoxie et récupérés à 30min, 3h, 8h et 24h. Seuls les sphéroïdes à 24h d'hypoxie n'ont pas pu être récupérés car ils étaient délités par désolidarisation des cellules. Après inclusion en paraffine, les marquages d'hypoxie et du RA étaient réalisés aux différents temps. Plus les sphéroïdes étaient exposés à une hypoxie, plus le gradient de marquage du RA s'accentuait : les cellules les plus centrales perdaient le marquage rapidement (dès 30 min) et cette zone s'étendait au fur et à mesure que l'hypoxie perdurait du centre vers la périphérie. Nous avons regroupé plusieurs sphéroïdes récupérés chacun à 30 min, 3h et 8h respectivement afin d'analyser les images à l'aide du logiciel NDP View. L'épaisseur moyenne de la couronne périphérique exprimant le marquage du RA était mesurée pour 5 sphéroïdes à chaque condition (Figure 5, Figure 6).


Figure 5
Figure 5. 

Coupes de sphéroïdes C4-2B à J7 après mise en hypoxie 30min, 3h et 8h. Les images ont été traitées avec le logiciel NDP View afin de mesurer l'épaisseur de la zone exprimant le RA en fonction de la durée de mise en hypoxie, et de comparer l'évolution de cette épaisseur avec 5 sphéroïdes pour chaque temps d'hypoxie. Cette figure ne montre qu'un exemple de chaque. A. Marquage du RA après 30min d'hypoxie. B. Marquage du RA après 3h d'hypoxie. C. Marquage du RA après 8h d'hypoxie. Grossissement 20×. Les sphéroïdes laissés 24h en hypoxie n'ont pas pu être récupérés car désagrégés.




Figure 6
Figure 6. 

Profil d'évolution du marquage RA en fonction du temps de mise en hypoxie des sphéroïdes C4-2B à J7. Les sphéroïdes sont placés dans une enceinte à hypoxie pendant 30min, 3h, et 8h et l'épaisseur de leur couronne de marquage du RA a été mesurée et comparée (moyenne de 5 expériences indépendantes) (** : p <0,01, *** : p <0,001).




Analyse des protéines


Pour chaque condition expérimentale de culture standard 2D (normoxie 6h et 24h, hypoxie 6h et 24h), l'analyse des protéines par western blot a permis d'étudier les variations d'expression du RA et de HIF-1α, principal reflet de l'hypoxie.


La comparaison de l'expression du RA et de HIF-1α en normoxie (Nx) et en hypoxie (Hx) selon les conditions précédemment décrites, montrait que l'hypoxie entraîne une augmentation de HIF-1α proportionnelle à sa durée. En comparaison avec les conditions normoxiques, l'expression du RA dans la lignée C4-2B était augmentée de 80 % après 6h d'hypoxie et reste stable à 24h d'hypoxie (Figure 7). Dans la lignée 22rv1, l'expression du RA était augmentée de 40 % après 6h d'hypoxie et diminuait de 30 % après 24h d'hypoxie.


Figure 7
Figure 7. 

Expression du RA dans la lignée C4-2B. Les cellules ont été placées dans une enceinte à hypoxie (0,1 % O2 ) pendant 6h et 24h, avec un groupe témoin normoxique (21 % O2 ) à chaque fois. La quantification de l'hypoxie au niveau cellulaire s'est faite par détection de HIF-1α. Le taux de RA est analysé pour chaque condition, les gels ont été quantifiés et les facteurs de multiplication sont indiqués.




Dosage du PSA sécrété


Afin de corréler cette expression différentielle du RA en zone hypoxique à une augmentation de l'activité transcriptionnelle, l'effet de l'hypoxie sur la sécrétion de PSA par les sphéroïdes était observé. Le PSA étant sécrétée par les cellules prostatiques en réponse à l'activation du promoteur du gène cible après translocation nucléaire du RA activé, la faisabilité de ce dosage dans le milieu de culture surnageant des sphéroïdes a tout d'abord été vérifié, en condition normoxique à J7 et J14, et en contrôlant l'absence de l'enzyme en situation basale dans le milieu de culture (RPMI 1640+10 % SVF) : le liquide surnageant des STM 22rv1 contenait un taux de PSA égal à 31 ng/mL à J7 et 213,7 ng/mL à J14 ; le liquide surnageant des STM C4-2B contenait quant à lui un taux de PSA 1141 ng/mL à J7 et de 8102,5 ng/mL à J14.


Puis ce dosage était réalisé en situation hypoxique dans le surnageant de sphéroïdes C4-2B à J7 (intrinsèquement non hypoxiques). Ces derniers étaient placés dans une enceinte à hypoxie et prélevés à 30 min, 3h, 8h et 24h. Pour chaque condition, le même dosage était réalisé à des temps identiques sur des surnageant de sphéroïdes à J7 en condition normoxique. Il existait une augmentation significative de sécrétion du PSA par les sphéroïdes placés en hypoxie à partir de 3h (p <0,005) comparativement au groupe témoin normoxique (Figure 8).


Figure 8
Figure 8. 

Sécrétion de PSA par les sphéroïdes C4-2B à J7 placés en normoxie (Nx) et en hypoxie (Hx). Les sphéroïdes sont placés dans une enceinte à hypoxie (0,1 % O2 ) à J7 de leur croissance, avec un groupe témoin laissé en normoxie (21 % O2 ), pendant 30min, 3h, 8h et 24h. Le surnageant est récupéré et le PSA dosé comparativement (moyenne de 3 expériences indépendantes) (* : p <0,005). A. Profil de sécrétion du PSA au cours du temps. B. Comparaison des quantités sécrétées à chaque temps.





Discussion


Le modèle des sphéroïdes tumoraux multicellulaires (STM)


La croissance tumorale intègre dans sa dynamique des interactions complexes entre cellules tumorales, évoluant dans un environnement biochimique étroitement dépendant de la proximité d'une vascularisation efficace (pH, pPO2 , nutriments). Les mécanismes de contrôle du cycle cellulaire sont également tributaires des interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire [13]. Diverses avancées technologiques permettent aujourd'hui de reproduire en culture certaines des étapes fondamentales de la croissance tri-dimensionnelle [14]. Les STM permettent en effet d'étudier les interactions (entre cellules ou entre cellules et matrice extracellulaire) dans un modèle 3D reproduisant en culture une grande partie de la complexité tumorale. Les STM lorsqu'ils atteignent une taille supérieure à 500 microns, élaborent un gradient progressif de cellules en prolifération similaire à celui observé dans les microrégions non vascularisées d'une tumeur et de ses métastases [15]. Les cellules en division sont situées dans les couches extérieures et les cellules quiescentes dans la région centrale avec une pression partielle en oxygène et un apport en nutriment moindres. Ce modèle permet donc d'étudier l'hypoxie à une échelle plus proche du modèle tissulaire que cellulaire.


Si les STM intègrent les interactions intercellulaires et un gradient de disponibilité en oxygène et en nutriments, ils n'intègrent pas les interactions entre cellules et stroma/matrice extracellulaire rencontrées dans les tumeurs solides primitives. De même, il n'existe aucune structure vasculaire au sein des sphéroïdes, et l'on connaît l'importance des interactions entre vaisseaux et tumeurs. Ceci constitue donc encore la principale limite de ce modèle. L'absence de vascularisation peut cependant constituer un modèle proche de certaines micro-métastases osseuses prostatiques, avasculaires car n'ayant pas encore développé de néo-vaisseaux.


Relation entre récepteur aux androgènes (RA) et hypoxie


Les études IHC menées sur les sphéroïdes à J7 (<500μm, sans gradient d'hypoxie) et J14 (>500μm, avec gradient d'hypoxie) mettaient en évidence un marquage différentiel du RA prédominant en zone non hypoxique. Ce gradient d'expression du RA sur les sphéroïdes à J14 avait une épaisseur moyenne d'environ 200μm, ce qui correspond à la profondeur maximale de pénétration tissulaire de l'oxygène : il existait donc une probable relation de cause à effet entre hypoxie et expression du RA à ce niveau. Cette « disparition » du marquage du RA en zone hypoxique pouvait être interprétée de deux façons : puisqu'à l'état basal le RA monomérique est en situation cytoplasmique et en attente d'un ligand, soit le RA était moins présent au niveau des cellules centrales hypoxiques, soit l'épitope que reconnaît l'anticorps anti-RA était moins accessible à ce niveau en raison d'un changement de conformation (dimérisation) et/ou d'une translocation nucléaire par activation du récepteur. Cette hypothèse était étayée par le fait que l'épitope reconnu par l'anticorps utilisé se situe au niveau du domaine N-terminal (NTD) du récepteur participant au changement de structure 3D de la protéine lors de son activation. Lorsque l'expérience était renouvelée en démasquant les épitopes, on constatait la réapparition du marquage. Le RA était donc bien présent au niveau des zones hypoxiques, mais massivement activé à ce niveau et transloqué au niveau du noyau. Ces résultats étaient appuyés par la mise en hypoxie des sphéroïdes à J7 : on observait une diminution progressive du marquage du RA au centre du sphéroïde proportionnelle à la durée de mise en hypoxie.


En plus de l'activation du RA, les études 2D montraient quant à elles que l'hypoxie entraînait une augmentation de l'expression du RA de 80 % dans la lignée C4-2B et de 40 % dans la lignée 22rv1, à 6h de privation d'oxygène. Cette augmentation du nombre de RA rapide dès 6h d'hypoxie fait se poser la question de son origine : synthèse de novo ou libération d'un pool pré-synthétisé ? L'épuisement du phénomène à 24h d'hypoxie traduit un très probable mécanisme complexe et multifactoriel. D'autres expériences utilisant des inhibiteurs de la synthèse des protéines seront nécessaires afin de répondre à cette question.


Enfin, cette activation ainsi que cette augmentation d'expression médiée par l'hypoxie se traduisaient en pratique par une augmentation de sécrétion du PSA par les sphéroïdes placés en hypoxie comparés à ceux laissés en normoxie. Ceci permettait de supposer que les effets précédemment observés étaient des phénomènes actifs d'adaptation à l'hypoxie cellulaire, se traduisant par une augmentation de l'activité transcriptionnelle des éléments de réponse aux androgènes (ARE) situés au niveau des promoteurs des gènes cibles.


Conclusion


L'activation du RA, l'augmentation de son expression et de son activité transcriptionnelle par l'hypoxie étaient déjà connues grâce aux précédents travaux sur des modèles 2D, avec une hypoxie cellulaire induite. Le modèle utilisé, plus proche de l'hypoxie tissulaire observée dans les tumeurs primitives, tend à confirmer l'idée qu'au niveau des tumeurs solides prostatiques, et particulièrement au niveau des métastases osseuses, l'hypoxie intratumorale contribue de manière importante aux mécanismes adaptatifs de résistances à la castration. Cependant, une analyse transcriptionnelle (qPCR du RA, HIF, VEGF, PSA) serait intéressante pour soutenir les résultats avancés par cette approche protéomique.


Déclaration de liens d'intérêts


Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.




Tableau 1 - Anticorps utilisés en immunohistochimie (IHC) sur coupe congelée.
  Prolifération  Apoptose  Hypoxie  RA 
Anticorps  KI67 (H-300) Santa Cruz  PARP-1 (Cleaved p25) Epitomics  Hypoxyprobe-1 Plus Kit  AR441 Abcam 
Cible (Pm)  KI67 (395kDa)  PARPc (25kDa)  pO2<10mmHg  RA (110kDa) 
Ac primaire (dilution)  IgG (1/100)  IgG (1/500)  IgG (100mMol incubé 2h)  IgG (1/25) 
Ac secondaire (dilution)  Texas red anti-rabbit (1/400)  Texas red anti-rabbit (1/400)  FITC green anti-mouse (1/100)  Texas red mouse (1/400) 




Références



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