Hommage au Pr Dominique CHOPIN - Analyse des mutations des gènes cibles de l'instabilité microsatellite dans les tumeurs urothéliales du haut appareil urinaire

14 juillet 2006

Mots clés : Tumeur urothéliale, haut appareil urinaire, syndrome HNPCC, instabilité des microsatellites, gènes cibles
Auteurs : Pierre Mongiat-Artus, Catherine Miquel, Madelon van der Aa, Olivier Buhard, Richard Hamelin, Hany Soliman, Chris Bangma, Anne Janin, Pierre Teillac, Theodorus van der Kwast, Françoise Praz
Référence : Prog Urol, 2005, 15, 6, 1286-1292, suppl. 1
Un certain nombre de tumeurs urothéliales du haut appareil urinaire (UUC pour urothelial cell carcinoma), sporadiques ou qui se développent dans le cadre du syndrome du cancer colorectal héréditaire sans polypose (HNPCC pour hereditary non polyposis colorectal cancer), présentent une instabilité des microsatellites (MSI pour microsatellite instability). Cette instabilité des microsatellites est le reflet d'un défaut du système de réparation des mésappariements de bases de l'ADN (MMR pour mismatch repair). Ainsi, les tumeurs MSI accumulent des mutations dans de nombreux gènes qui comportent dans leurs séquences codantes des séquences répétées ; ces mutations conduisent à un décalage du cadre de lecture et sont responsables de la synthèse d'une protéine tronquée. Après avoir évalué l'incidence du phénotype MSI dans 58 UUC à l'aide des deux panels de marqueurs recommandés par le National Cancer Institute, nous avons étudié la distribution intra-tumorale des mutations secondaires de la mutagenèse MSI dans 13 gènes cibles potentielles.
Parmi les 58 UUC évaluées, 4 (7%) présentaient un phénotype MSI. Deux patients étaient atteints d'un syndrome HNPCC. Trois des 4 tumeurs comportaient des mutations de MSH3, BAX, MRE11 et RAD50. Des mutations d'autres gènes, impliqués dans des voies cellulaires clés (ATR, DNA-PKcs, MBD4, TCF-4, MSH6 et BLM), ont été aussi détectées. Les mutations de BAX et de MRE11 étaient présentes de façon homogène au sein des 3 tumeurs. Une analyse immunohistochimique a confirmé la perte d'expression d'une des protéines du système MMR dans chaque tumeur (MLH1, MSH2 et MSH6). Elle a aussi montré qu'une mutation de MRE11 ou de RAD50 induit la perte d'expression conjointe des deux protéines, qui font partie d'un même complexe protéique (MRE11/RAD50/NBS1).
Les UUC avec un phénotype MSI sont rares et les mutations de RAD50 et de MRE11 y sont fréquentes et probablement précoces, suggérant leurs rôles clés dans la genèse de ces tumeurs.

I. Introduction

Les tumeurs urothéliales sont un des cancers les plus fréquents, responsables de 10% de la mortalité par cancer. La majorité de ces tumeurs se développe dans la vessie, mais 5% apparaissent dans le haut appareil urinaire, calices, bassinet et uretère. Actuellement, le diagnostic de tumeur urothéliale du haut appareil urinaire (UUC) est généralement porté à l'occasion du suivi d'une tumeur urothéliale de vessie. Les UUC apparaissent de façon sporadique, mais des facteurs héréditaires peuvent aussi présider à leur développement, certains cas survenant dans le cadre du syndrome du cancer colorectal héréditaire sans polypose ou syndrome HNPCC [3]. Le syndrome HNPCC est une maladie héréditaire de transmission autosomique dominante due à une mutation germinale dans un des gènes du système MMR, généralement MLH1 ou MSH2 et plus rarement MSH6 ou PMS2 [25]. Ce syndrome est caractérisé par un risque élevé de cancer colorectal (82%), de cancer de l'endomètre (60%), ainsi que de cancer de l'estomac (13%), ovarien (12%), urothélial du haut appareil urinaire (4%), cérébral (3,7%) et hépato-biliaire (2%) [1, 30, 33, 34].

L'instabilité des microsatellites (MSI) est un phénotype tumoral révélateur d'un défaut du système MMR, caractéristique des tumeurs HNPCC et de 15% des cancers colorectaux sporadiques. Les mutations germinales des gènes du système MMR sont la cause principale du syndrome HNPCC, alors que la méthylation du promoteur de MLH1 est le mécanisme dominant de l'inactivation du système MMR dans les tumeurs sporadiques [18, 20]. Les microsatellites sont de courtes séquences répétées de l'ADN, dispersées dans tout le génome, particulièrement sujettes aux mutations de type insertion ou délétion qui surviennent durant la réplication. De nombreux marqueurs microsatellites et critères diagnostiques ont été utilisés pour déterminer le phénotype MSI des tumeurs, conduisant à des résultats extrêmement variables et contradictoires. Le consensus de Bethesda a été un point de repère important pour standardiser l'analyse du phénotype MSI dans les tumeurs colorectales ; il a recommandé l'utilisation d'un panel de 5 marqueurs (2 mononucléotidiques et 3 dinucléotidiques) dans la tumeur et l'ADN normal pour classer les tumeurs en MSI-High (MSI-H, MSI sur 2 loci ou plus), MSI-Low (MSI-L, MSI sur 1 locus) ou MSS (MS stable, sans instabilité) [6]. Seul le phénotype MSI-H caractérise les tumeurs HNPCC ou sporadiques qui comportent un défaut du système MMR. Cependant, l'utilisation du panel original de Bethesda n'est pas exempte de difficultés techniques en particulier, l'utilisation d'un trop grand nombre de marqueurs dinucléotidiques a conduit à classer des tumeurs de façon erronée en MSI-High. Ainsi, la dernière réunion de consensus a récemment recommandé, comme une alternative au panel original de Bethesda, l'utilisation de 5 marqueurs mononucléotidiques quasi-monomorphes couplés dans une seule PCR dite « pentaplex » [7, 31, 32]. Cette PCR permet un dépistage rapide d'un grand nombre d'échantillons tumoraux avec une grande spécificité et une grande sensibilité et une interprétation univoque des résultats sans avoir recours à l'ADN normal des patients.

Les études portant sur le statut MSI des tumeurs urothéliales du haut appareil urinaire sont rares et l'incidence du phénotype MSI déterminé en utilisant le panel de Bethesda classique dans ces tumeurs varie de 4 à 31% [5, 8, 12, 17, 29]. Ces variations peuvent résulter de problèmes d'interprétation des marqueurs dinucléotidiques, de l'utilisation de critères moins stringents que ceux exigés par la conférence de consensus et de populations d'étude différentes. Les UUC MSI-H ont été décrits comme survenant plus volontiers dans l'uretère, présentant une croissance inversée et un taux d'envahissement musculaire plus faible par rapport aux UUC MSI-L et MSS [8, 16, 17]. Les cancers colorectaux MSI possèdent aussi des caractéristiques cliniques et pathologiques spécifiques : un risque métastatique moindre, une meilleure survie et une réponse spécifique à la chimiothérapie [13, 27]. Il paraît ainsi important de pouvoir identifier avec certitude les UCC MSI.

La carcinogénèse des tumeurs MSI est un processus évolutif dans lequel l'instabilité des microsatellites provoque l'accumulation et la sélection d'un grand nombre de mutations secondaires inactivatrices dans des régions codantes de gènes, dits cibles, qui peuvent promouvoir la carcinogenèse [9, 36]. La plupart des études réalisées sur les gènes cibles ont été effectuées dans des cancers du côlon, de l'endomètre et de l'estomac ; elles suggère une spécificité tissulaire, la fréquence de mutation d'une gène cible donné étant variable selon l'organe où les tumeurs se développent [9, 22, 26]. Aucune étude exhaustive des mutations des gènes cibles dans les UUC MSI n'a été réalisée.

Après avoir établi avec précision l'incidence du phénotype MSI dans les tumeurs urothéliales du haut appareil urinaire sur une série de 58 patients, nous avons recherché dans les tumeurs MSI la présence de mutations dans un grand nombre de gènes cibles candidats (n=13) impliqués dans des voies cellulaires clés. Afin d'identifier les gènes cibles de la carcinogenèse MSI dans les tumeurs urothéliales, de multiples sites tumoraux ont été analysés simultanément pour chaque tumeur afin d'évaluer l'hétérogénéité des mutations des gènes cibles dans les tumeurs.

II. Matériel et méthodes

Patients.

Les patients ont été sélectionnés à partir d'une cohorte de 58 patients présentant une tumeur urothéliale primitive du haut appareil urinaire prise en charge entre 1988 et 2004 soit à l'Erasmus Medical Center de Rotterdam, soit à l'hôpital Saint-Louis de Paris. Le statut MSI a été établi en utilisant la PCR pentaplex de 5 marqueurs mononucléotidiques quasi-monomorphes récemment recommandée par le NCI du fait de sa fiabilité prouvée dans l'évaluation des cancers colorectaux MSI (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 et NR-27) [6,31,32]. Le phénotype MSI était retenu en cas d'instabilité de 3 marqueurs ou plus. Les résultats ont été confirmés à l'aide du panel original de Bethesda (BAT-25, BAT-26, D5S346, D2S123 et D17S250) [23]. Afin d'identifier, les gènes cibles de la carcinogenèse MSI dans les tumeurs urothéliales, nous avons recherché la présence de mutations des gènes cibles dans les tumeurs provenant de 7 patients : quatre tumeur MSI et trois tumeurs qui comportaient des variants dans 1 des 5 marqueurs microsatellites utilisés pour détecter le phénotype MSI.

Les données cliniques et anatomopathologiques ont été collectées dans le Tableau 1. La classification des tumeurs a été réalisée selon les critères de l'OMS et l'IUAC de 1998 [11].

Sélection des tumeurs et extraction de l'ADN.

L'ADN tumoral et normal a été extrait à partir de blocs tissulaires inclus en paraffine à l'aide du kit DNeasy™Tissue Kit (Qiagen, Germany). Le parenchyme rénal ou la couche musculaire urétérale ont été sélectionnés pour l'extraction d'ADN normal. Les zones tumorales comprenant plus de 80% de cellules cancéreuses ont été sélectionnées pour être microdisséquées sous un microscope inversé (x40). De 2 à 5 zones tumorales ont pu être microdisséquées pour chaque tumeur. La tumeur primitive d'une patiente (#4) était fixée au Bouin, ainsi seules les 2 récidives ont pu être analysées (#4-R1, #4-R2).

Détection des mutations dans les gènes cibles.

Treize gènes ont été sélectionnés en raison de leur implication dans des voies cellulaires clés. A l'exception de MRE11, la séquence répétée microsatellite de tous ces gènes est située dans leur séquence codante (Tableau 2). Seul MRE11 comporte une répétition microsatellite qui se situe dans une séquence intronique. La technique de détection des mutations dans les répétitions mononucléotidiques de ces 13 gènes a déjà été détaillée [23]. Chaque PCR avec des profils anormaux a été réalisée au moins 2 fois de façon indépendante pour confirmer la présence de mutations.

III. Résultats

Caractéristiques cliniques et pathologiques des tumeurs MSI (Tableau 1)

Deux des 4 patients ayant une tumeur MSI étaient atteints d'un syndrome HNPCC (#1 et #4). Leur tumeur présentait une perte d'expression immunohistochimique conjointe de MSH2 et MSH6. Les deux autres tumeurs présentaient une perte d'expression de MLH1. L'âge au moment du diagnostic des tumeurs MSI était significativement plus jeune que celui des tumeurs MSS (42 versus 65 ans). Contrairement aux patients dont les tumeurs étaient de phénotype MSS, aucun des patients avec des tumeurs MSI n'avait présenté de tumeur vésicale avant la tumeur du haut appareil urinaire, mais cette différence n'était pas significative. Les tumeurs MSI, de répartition hétérogène en grade et stade, étaient localisées dans le bassinet chez 1 patient, l'uretère chez 2 patients et le bassinet et l'uretère chez 1 patient. Le suivi des patients porteurs de tumeurs MSI variait de 18,2 à 142,1 mois. Un patient était décédé lors de l'étude.

Altérations des gènes cibles (Tableau 2)

La majorité des 13 gènes analysés ont déjà été décrits comme des cibles fréquentes de mutations secondaires de la mutagenèse MSI [9, 36]. A l'exception de MRE11, les mutations sont situées dans la séquence codante de ces gènes et conduisent à la synthèse d'une protéine tronquée non fonctionnelle. Les mutations de MRE11 entraîne un défaut d'épissage conduisant à la synthèse d'une protéine tronquée rapidement dégradée responsable d'une diminution importante de l'expression protéique [15]. Les 4 tumeurs MSI de notre étude présentaient 2 à 7 gènes mutés parmi les 13 gènes analysés (18% à 63% de gènes mutés). Aucune des trois tumeurs avec des variants dans un des cinq marqueurs utilisés pour le type MSI (classées MSI-L) ne présentait de mutations dans les gènes cibles. Quatre tumeurs MSI avaient une mutation de MSH3, 3 une mutation de BAX, RAD50 et MRE11, suggérant que ces gènes sont des gènes cibles fréquents dans les UUC MSI. De plus, deux tumeurs MSI avaient des mutations de TGFb-RII, TCF-4, MSH6, MBD4 et ATR. Nous n'avons trouvé qu'une seule tumeur porteuse de mutation de DNA-PKcs ou BLM. Parmi les 13 gènes étudiés, seuls BRCA1 et BRCA2 n'étaient pas l'objet de mutation et ont donc été exclus des calculs de taux de mutation.

Nous avons voulu évaluer la distribution intra-tumorale de ces mutations en analysant plusieurs sites tumoraux pour chaque tumeur. Parmi les mutations les plus fréquentes, les mutations de BAX et de MRE11 étaient présentes dans de multiples sites étudiés, contrairement aux autres mutations, dont les distributions étaient beaucoup moins uniformes. La comparaison du profil des mutations survenues dans les deux récidives tumorales successives du patient #4 a permis de mettre en évidence une accumulation des mutations dans les gènes cibles au cours du temps, BAX et MRE11 étant les plus précoces.

Afin d'évaluer la signification biologique des mutations observées dans les gènes MRE11 et de RAD50, nous avons étudié l'expression immunohistochimique de deux protéines MRE11 et RAD50. Dans le tissu normal, leur expression était ubiquitaire, de localisation nucléaire et de forte intensité. Dans les tumeurs, les mutations de MRE11 ou de RAD50 s'accompagnaient d'une extinction concomitante de l'expression immunohistochimique des deux protéines.

IV. Discussion

L'objectif de cette étude était de caractériser dans des UUC MSI les mutations de 13 gènes cibles potentielles de l'instabilité des microsatellites .

L'incidence du phénotype MSI que nous avons trouvée dans les UUC (7%) est plus faible que celle rapportée dans la majorité des publications antérieures, en dehors d'une d'entre elle, fixant cette incidence à 4% après utilisation d'une méthodologie identique à la nôtre [12].

Les tumeurs avec un défaut du système de réparation des mésappariements de bases, accumulent des mutations dans des répétitions mononucléotidiques situées de régions codantes de gènes dits cibles [9, 36]. Ces mutations peuvent être sélectionnées et contribuent à l'initiation ou la progression des tumeurs par l'intermédiaire d'une perte de la régulation de la croissance cellulaire, d'un échappement à l'apoptose ou d'un défaut de réparation de l'ADN. Il est intéressant de noter que la sélection des mutations des gènes cibles dans les tumeurs MSI semble spécifique du tissu dans lequel les tumeurs se développent, avec des profils de mutations des gènes cibles distincts dans les cancers de l'endomètre et cancers colorectaux [9, 36]. L'examen de 13 gènes cibles potentiels de l'instabilité des microsatellites dans les UUC MSI avait pour but d'obtenir des informations supplémentaires sur l'impact potentiel de leur inactivation. A notre connaissance, l'analyse de gènes cibles dans les UUC MSI n'a été réalisée qu'une fois sur 15 tumeurs et sur 5 gènes [16]. Des altérations de MSH6 (38%), TGFb-RII (23%), BAX (23%) et MSH3 (15%) ont ainsi été rapportées. Nous avons observé des altérations fréquentes de MSH3, MRE11, RAD50 et BAX et décrit des mutations dans d'autres gènes impliqués dans le maintien de l'intégrité du génome comme ATR, DNA-PKcs, MBD4 et BLM. Notre étude souligne l'intérêt de pratiquer une recherche mutationnelle sur de multiples sites tumoraux, plutôt que sur un seul site. Premièrement, une telle approche nous a permis de détecter des mutations ne survenant que dans une seule partie de la tumeur. Deuxièmement, cette procédure identifie les mutations survenant de façon homogène au sein de la tumeur, ce qui reste un argument en faveur de leur survenue précoce au cours de la carcinogenèse. Plusieurs études se sont intéressées dans les cancers colorectaux MSI à l'homogénéité et la précocité des mutations de TGFb-RII, et dans une moindre mesure de celles de BAX [2, 4]. La faible fréquence et l'hétérogénéité des mutations de TGFb-RII observées dans notre étude plaident contre une implication précoce de ce gène dans la transformation initiale dans les UUC MSI [16, 35]. A l'opposé, les mutations de BAX et MRE11, deux gènes fréquemment altérés et de façon homogène au sein des tumeurs, semblent être sélectionnées précocement et participer à la carcinogenèse urothéliale MSI. BAX est un gène pro-apoptotique de la famille Bcl-2. C'est un des gènes les plus souvent mutés dans les cancers colorectaux MSI et ces mutations sont associées à une accélération de la croissance tumorale et une diminution de l'apoptose [16, 19, 28, 36]. MRE11 forme avec RAD50 et NBS1 un complexe protéique qui joue un rôle majeur dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN [14, 21]. Comme cela a déjà été décrit dans d'autres organes, nous avons montré qu'une mutation des gènes MRE11 ou RAD50 est associée à une diminution d'expression conjointe des protéines MRE11 et RAD50, suggérant une inactivation du complexe MRE11/RAD50/NSB1 dans les UUC MSI [14, 15, 24].

Nous suggérons donc que BAX et MRE11 puissent être des gènes cibles valides, jouant un rôle prédominant dans la progression des UCC MSI à l'opposé des autres gènes que nous avons étudiés. De façon cohérente avec cette hypothèse, seuls les gènes BAX et MRE11 présentaient des mutations dans la première récidive d'une patiente, alors que la seconde récidive avait accumulé des mutations dans d'autres gènes cibles.

V. Conclusion

L'étude conjointe dans plusieurs sites tumoraux d'un grand nombre de gènes cibles potentielles de l'instabilité des microsatellites dans les tumeurs urothéliales devraient permettre d'identifier des gènes cibles, notamment BAX et MRE11, dont l'inactivation pourrait favoriser la carcinogenèse de ces tumeurs et, par là-même, suggérer des cibles thérapeutiques spécifiques.

Remerciements

Pour mener à bien ce travail, Pierre Mongiat-Artus a bénéficié d'une bourse d'étude de l'Association Française d'Urologie et Catherine Miquel d'une bourse d'étude de la Fondation pour la Recherche Médicale.

Les auteurs remercient la revue Oncogene de leur avoir permis d'utiliser dans cet article les données publiées pages 2113 à 2118 dans le numéro 14 du volume 25 de mars 2006 [23].

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