Evaluation de IGL-1, une nouvelle solution de conservation d'organes : résultats pré-cliniques en transplantation rénale

16 septembre 2005

Mots clés : Ischémie/reperfusion, solution de conservation, prélèvement multi-organes, solution extra-cellulaire, polyéthylène glycol, transplantation rénale.
Auteurs : BADET L., BEN ABDENNEBI H., PETRUZZO P., McGREGOR B., ESPA M., HADJ-AISSA A., RAMELLA-VIRIEUX S., STEGHENS J.P., PORTOGHESE F., MORELON E., MARTIN X
Référence : Prog Urol, 2005, 15, 481-488
Introduction: Les lésions d'ischémie et de reperfusion rénale conditionnent en partie la survie des greffons à court et long terme. Les conditions de conservation semblent jouer un rôle déterminant. Ce travail a pour but de présenter les résultats expérimentaux pré-cliniques obtenus en transplantation rénale avec une solution de conservation de type extra-cellulaire dans laquelle le Polyéthylène Glycol (PEG) est utilisé comme colloide. Méthodes et Résultats: Les effets d'une inversion des gradients de Na+ et de K+ dans la solution de conservation IGL-1 par rapport à l'UW et du remplacement de l'Hydroxyléthyl amidon (ou hydroxyethyl Starch : HES) par du PEG ont été évalués dans un modèle de rein isolé et perfusé de rat ex vivo puis dans un modèle d'auto-transplantation rénale chez le porc. Dans ces modèles expérimentaux, après 24 heures de conservation statique, la fraction de réabsorption du sodium corrélée à la qualité des fonctions tubulaires du rein et le taux de filtration glomérulaire ont été constamment meilleurs dans le groupe IGL-1 que dans le groupe UW. In vivo, chez le porc, les reprises de fonction rénale ont été significativement meilleures dans le groupe IGL-1 et l'étude histologique a permis de mettre en évidence une réduction significative de l'expression du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) de type II, marqueur indirect de l'inflammation, mais également une diminution des marqueurs d'apoptose et de fibrose pour les reins préservés dans IGL-1. Conclusions: IGL-1 donne, en transplantation rénale chez l'animal, une meilleure reprise de fonction rénale que UW qui reste jusqu'à aujourd'hui le "gold standard" des solutions de conservation. Des résultats complémentaires seront nécessaires pour déterminer si cette solution de nouvelle génération est susceptible de s'imposer comme la solution de référence et remplacer UW.



Les conditions de conservation des organes jusqu'à leur revascularisation semblent jouer un rôle clef dans leur reprise de fonction immédiate mais également sur leur fonctionnement au long cours [6, 22, 30]. Des lésions tissulaires plus au moins réversibles vont en effet se constituer durant les périodes d'ischémie froide et chaude puis s'aggraver au moment de la reperfusion de l'organe.

La problématique des lésions d'ischémie et de reperfusion devient d'autant plus importante que les équipes de transplantation sont de plus en plus confrontées à des greffons marginaux provenant de donneurs âgés souvent hypertendus et quelquefois diabétiques, ce qui rend impératif une optimisation des conditions de conservation des reins. Les liquides de conservation ont à ce titre un intérêt majeur puisque, de leur composition, va en partie dépendre l'importance des lésions tissulaires qui se constitueront durant l'ischémie et lors de la reperfusion de l'organe.

C'est historiquement à la fin des années 80 que la solution de Belzer ou UW fait son apparition pour tenter d'améliorer les résultats cliniques très critiqués obtenus avec Euro Collins, en particulier en greffe de foie et de pancréas [32, 33]. UW démontrera de façon indiscutable sa supériorité sur Euro Collins [23, 27] et reste encore aujourd'hui la solution de référence. Cependant différents travaux vont permettre de montrer que les solutions intracellulaires riches en potassium présentent un certain nombre d'inconvénients et qu'un UW extracellulaire (Na-UW) donne dans des modèles expérimentaux de référence tant pour le foie [3] que pour le rein [26] de meilleures reprises de fonction. Par ailleurs le remplacement de l'HES par du PEG a permis de montrer une amélioration significative des reprises de fonction hépatique [2] après transplantation, ce qui nous a incité à tester cette molécule en transplantation rénale [8, 11, 13]. Le PEG apparaît d'autant plus intéressant que ses propriétés structurales lui permettent d'induire un effet d'immunomasquage (par simple couverture du complexe majeur d'histocompatibilité) [7] au niveau du greffon ce qui pourrait diminuer l'importance de la réaction allo-immune au moment et dans les heures qui suivent la transplantation, fait qui pourrait être déterminant dans une meilleure acceptation immunologique des greffons au long cours.

Ce travail présente donc les résultats expérimentaux que nous avons obtenus en utilisant IGL-1 comme solution de conservation. Ils sont comparés à ceux obtenus dans les mêmes conditions de conservation avec UW. Nous présenterons dans un premier temps les résultats acquis en utilisant un modèle d'étude ex vivo de rein de rat isolé et perfusé puis un modèle in vivo d'auto-transplantation rénale chez le porc.

MATERIELS ET METHODES

Solution de conservation

La composition d'IGL-1 est présentée dans le Tableau I. La solution de Belzer à été modifiée en inversant le gradient de concentration du Sodium et du Potassium pour en faire une solution de type extracellulaire (riche en Na+ et faiblement dosée en K+ : Na-UW). L'HES a été remplacé par du PEG d'un poids moléculaire de 35000 Daltons et utilisé à une concentration de 0.03 mM (PEG 35)

Rein isolé et perfusé de rat

Protocole expérimental

Des rats mâles de lignée Sprague Dawley (Iffa-Credo, France) pesant 200-250 g ont été utilisés pour cette partie du travail expérimental.

24 rats ont été randomisés dans 4 groupes (n=6) :

- groupe contrôle sans ischémie froide

- 24 heures de conservation dans UW

- 24 heures de conservation dans Na-UW (UW extracellulaire)

- 24 heures de conservation dans IGL-1 (Na-UW avec remplacement du HES par du PEG 35)

La technique de rein isolé et perfusé de rat a déjà été décrite [26]. Nous en rappelons les grands principes : anesthésie des rats par injection intra-péritonéale de Kétamine (35 mg/kg). Injection de 1000 UI d'héparine. Cathétérisme de l'uretère droit pour collecter l'urine. Cathétérisme de l'aorte sous-rénale pour mesurer la pression de perfusion, cathétérisme de l'artère mésentérique supérieure pour assurer la perfusion et mise en place d'un cathéter dans la veine cave inférieure supra-rénale pour collecter l'effluent veineux de la veine rénale droite. On réalise une néphrectomie droite élargie aux vaisseaux porteurs des cathéters. Le rein est alors rincé avec une solution de conservation (UW, Na-UW ou IGL-1) puis conservé durant 24 heures en incubation statique dans la même solution avant que ne soit effectuée l'exploration fonctionnelle rénale. Perfusion et étude de fonction rénale

Les reins sont perfusés en circuit fermé via l'artère mésentérique supérieure par une solution de type Kreibs-Henseleit à 37°C [6] enrichie en albumine (5%), en CO2 (5%) et en Oxygène (95%) pendant 75 minutes en assurant une pression de perfusion située entre 90 et 100 mmHg. Du polyfructosan (Inutest®, Laevosan, Linz, Austria) est ajouté à la solution pour permettre une évaluation du taux de filtration glomérulaire. Les pressions et les débits de perfusion sont enregistrés en continu. Après une période d'équilibrage de 30 minutes, des échantillons d'urine et de liquide de perfusion sont prélevés au niveau de la veine cave et de l'uretère 3 fois de suite à 15 minutes d'intervalle, ce qui permet le calcul d'une clairance du polyfructosan (dont la valeur est corrélée à la filtration glomérulaire) et d'un taux de réabsorption du Na+ qui évalue la fonction tubulaire.

Modèle d'auto-transplantation chez le porc

Protocole expérimental

Le travail expérimental a utilisé des porcs de variété "white pigs" pesant en moyenne 25 kg.

Seize porcs ont été utilisés et randomisés dans 3 groupes différents:

- groupe 1 : reins préservés dans une solution de UW : n=6

- groupe 2 : reins préservés dans une solution de IGL-1 : n=6

- groupe 3 : reins contrôles sham : n=4

Le rein gauche de chaque animal a été prélevé et lavé avec 250 ml de solution de conservation puis conservé durant 24 heures à 4°C dans les conditions habituelles de conservation statique avant d'être transplanté chez le même animal en respectant une ischémie chaude standardisée de 60 minutes. La fonction rénale des porcs a été évaluée par détermination quotidienne des taux de créatinine et d'urée sanguine et urinaire qui ont permis de réaliser des calculs de clairance de la créatinine et des calculs du taux de réabsorption du sodium témoin du fonctionnement tubulaire. Les mesures ont été effectuées quotidiennement, du jour de la greffe jusqu'au sacrifice de l'animal 7 jours après.

Des biopsies ont été effectuées avant et après la reperfusion le jour de la greffe puis le jour du sacrifice de l'animal et utilisées pour comparer l'importance des lésions entre les différents groupes. Une biopsie du rein droit a également été systématiquement réalisée avant la néphrectomie droite, préalablement à la greffe. Procédure chirurgicale

Tous les porcs ont reçu une prémédication à base de Tiletamine (10 mg/kg), de Zolazepam (7.5 mg/ kg) et d'atropine (10µg/kg) avant l'induction de l'anesthésique effectuée à l'Halotane. Une néphrectomie gauche a été réalisée dans des conditions stériles par lombotomie antérieure. Les reins des groupes 1 et 2 ont été lavés puis conservés respectivement dans UW ou IGL-1 après tirage au sort. Après 24 heures d'ischémie froide les porcs ont été réopérés par voie médiane pour subir une néphrectomie droite et une auto transplantation rénale gauche par anastomose latéro terminale de la veine rénale à la VCI et anastomose termino-terminale de l'artère rénale gauche à l'artère rénale droite en position orthotopique. Le temps d'ischémie chaude a été standardisé à 60 minutes et tous les reins ont été lavés avant transplantation avec une solution de ringer lactate. Une anastomose pyélo urétérale protégée par une sonde JJ entre l'uretère droit et le pyélon du rein gauche autotransplanté a été effectuée pour rétablir la continuité urinaire. Après 7 jours de suivi tous les animaux ont été sacrifiés et les reins prélevés pour une étude histologique.

Pour les animaux contrôles l'auto-transplantation rénale gauche a été réalisée après que la néphrectomie droite ait été effectuée durant la même intervention, les reins lavés avec du ringer lactate étant immédiatement retransplantés. Histologie et immunohistochimie

L'étude histologique a porté sur les biopsies réalisées le jour de la greffe et au moment du sacrifice de l'animal à J7. Chaque biopsie rénale a été incluse en paraffine avant que ne soit réalisée une étude en microscopie optique par coloration à l'hématoxiline-Eosine de chaque bloc.

Plusieurs coupes de chaque rein ont été examinées afin de permettre une cotation précise des lésions tissulaires prenant en compte les lésions tubulaires et glomérulaires, les lésions endothéliales ainsi que l'infiltration cellulaire du greffon. Un score cotant de 0 (rein normal) à 4 a été établi.

Une étude immunohistochimique a été effectuée sur les échantillons tissulaires prélevés à J7 lors du sacrifice de l'animal. Des anticorps monoclonaux marquant le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (MCA 1335, Serotec Ldt, Oxford, UK) témoin direct de l'expression des antigènes d'histocompatibilité et indirect de l'inflammation ont été utilisés ainsi que l'alpha actine (anti-a Smooth Muscle Actin, clone1A4, Sigma, Saint Louis, USA) témoin précoce des lésions de fibrose.

La technique dite du TUNEL [25] a été utilisée pour identifier et quantifier l'importance de l'apoptose sur les biopsies rénales réalisées le jour du sacrifice des animaux.

La quantification de l'immunomarquage a utilisé une méthode d'analyse d'image par le système Quantimed 600 (Leica, Cambridge, United Kingdom) [24].

Analyse statistique

Résultats exprimés en valeur moyenne ± SEM, excepté pour la quantification histologique où les résultats sont exprimés en valeur moyenne. La comparaison entre les groupes a utilisé un test ANOVA. Les valeurs ont été considérées comme statistiquement significatives pour p<0.05.

Résultats

Rein isolé et perfusé de rat

La fraction de réabsorption du sodium (FRNa) est significativement meilleure pour les reins conservés dans Na-UW que pour ceux conservés dans UW (Figure 1). Il en est de même pour le débit de filtration glomérulaire (GFR) (Figure 2). Lorsque le HES est substitué par le PEG35 l'amélioration des fonctions tubulaires et glomérulaires est encore plus nette.

Auto transplantation chez le porc

La créatinine plasmatique et l'urée des porcs augmentent durant les 72 premières heures après auto-transplantation des reins conservés pendant 24 heures que ce soit dans le groupe UW ou dans le groupe IGL-1, alors que ces valeurs sont normales dans le groupe contrôle. Cependant au delà de 72 heures, on assiste à une décroissance rapide de la créatinine et de l'urée pour les porcs dont le rein a été conservé dans IGL-1 alors que l'insuffisance rénale persiste dans le groupe de porcs dont les reins ont été conservés avec UW. Une semaine après l'auto-transplantation les valeurs de créatinine et d'urée sont comparables dans le groupe contrôle et IGL-1 alors qu'elles restent significativement supérieures (p<0.05) dans le groupe UW (Figures 3 et 4).

Un porc est mort d'insuffisance rénale aiguë dans le groupe UW alors que tous les porcs ont survécu dans le groupe IGL-1. Il n'y a pas de différence significative entre les clairances de créatinine du groupe contrôle et du groupe IGL-1 alors que les clairances sont significativement plus basses dans le groupe UW (Figure 5). Les valeurs de FRNa ne sont cependant pas significativement différentes entre les deux groupes.

En microscopique optique, sur des coupes colorées à l'hématoxyline et à l'éosine, aucune anomalie notable n'est mise en évidence sur les reins contrôles. Pour les reins autotransplantés, alors que peu d'anomalies glomérulaires sont visibles, des lésions tubulaires à type de vacuolisation du cytoplasme, de dilatation et de nécrose ont été mises en évidence dans les deux groupes étudiés sans qu'il soit possible, même après application d'un score, de trouver de différence significative entre les reins conservés dans UW ou IGL-1. Cependant comme le montre le Tableau II les reins préservés dans IGL-1 expriment significativement moins le CMH de classe II (Figure 6 A et B) et présentent un nombre de cellules apoptotiques significativement moins important que lorsque les reins ont été conservés avec UW (p<0.01 et p<0.006, respectivement) (Figure 6 C et D). Au moment du sacrifice des porcs, l'expression de l'a-SMA marqueur des lésions de fibrose est significativement plus élevée dans le tissu rénal des reins conservés dans UW que dans les reins conservés avec IGL-1 (p< 0.03) (Figures 6 E et F).

Figure 6 : Etude histologique comparant les reins préservés avec UW et les reins conservés avec IGL-1. 6A & 6B : Expression rénale du CHM II chez le porc 7 jours après l'auto-transplantation rénale. Temps d'ischémie froide et chaude respectivement standardisés à 24 heures et 1 heure. Marquage intense des reins préservés avec UW au niveau des capillaires péritubulaire, des cellules endothéliales et des espaces péritubulaires alors que seules quelques cellules expriment le CMH II après conservation avec IGL-1 6C & 6D : Marquage des cellules apoptotiques (TUNEL) sur des biopsies rénales réalisées chez les porcs 7 jours après l'auto-transplantation rénale. Temps d'ischémie froide et chaude respectivement standardisés à 24 heures et 1 heure. Le marquage des cellules tubulaires apparaît plus intense lorsque les reins ont été conservés avec UW. 6E & 6F : Expression rénale de l'a-actine, marqueur précoce des lésions de fibrose chez le porc 7 jours après l'autotransplantation rénale. Temps d'ischémie froide et chaude respectivement standardisés à 24 heures et 1 heure. Il existe une différence très significative d'expression de l'a-actine avec des lésions précoces de fibrose bien plus intenses pour les reins conservés avec UW.

Discussion

De nombreux travaux expérimentaux et cliniques ont permis de déterminer que les lésions d'ischémie et de reperfusion (IR) ont des répercussions majeures sur la reprise de fonction des greffons rénaux, sur la survenue du rejet aigu et sur la survie des greffons au long cours [6, 22, 30]. Ces lésions d'IR sont marquées par l'induction de lésions inflammatoires caractérisées par une infiltration du greffon par des cellules mononuclées activées du receveur, par une surexpression du CMH II et une prolifération lymphocytaire cytokine dépendante, mécanismes qui aboutissent à la destruction des tissus exposés (nécrose) ou à l'induction d'un signal de mort cellulaire (apoptose) notamment par la voie des caspases [5, 28]. Les lésions tubulaires sont habituellement en transplantation rénale un bon reflet de l'importance des lésions d'ischémie et de reperfusion [18] et s'accompagnent in vivo d'un retard de reprise de fonction des organes transplantés.

Le but des travaux que nous avons présentés a été de déterminer s'il était possible, en utilisant une solution de type extracellulaire contenant du PEG35 comme colloide (solution IGL-1), de mieux protéger les reins contre les lésions d'IR. Le rationnel de la substitution de l'HES par le PEG35 dans la solution Na-UW est basé sur la publication d'effets délétères de HES qui serait directement responsable d'une agrégation des globules rouges [21] lors de la reperfusion mais également sur un certain nombre d'études qui ont pu montrer que HES n'était pas indispensable au bon fonctionnement de UW [15] et que sa substitution par un PEG pouvait améliorer les reprises de fonction des reins [8]. Le remplacement de HES par PEG aurait par ailleurs un effet potentiel d'immunocamouflage décrit pour la première fois en transplantation cardiaque [4] en 1991 où l'utilisation de PEG a permis de diminuer l'incidence clinique des rejets aigus après transplantation cardiaque. Le PEG est en effet en mesure de se fixer sur les membranes cellulaires et de masquer durant les jours qui suivent la transplantation le complexe majeur d'histocompatibilité de type I et II [7] ; cet effet a bien été montré expérimentalement en transplantation hépatique [9, 29], rénale [13], intestinale [16], pancréatique [34], pulmonaire [17] et également lors de la greffe d'ïlots de Langerhans (résultats rapportés mais non encore publiés de l'équipe de Barrou). Le choix de l'utilisation d'un PEG d'un poids moléculaire de 35000 Daltons par rapport à un PEG de poids moléculaire plus faible a été décidé sur la base de travaux réalisés sur le foie qui ont pu montrer des reprises de fonction constamment meilleures avec un PEG 35000 comparé à un PEG 20000. Il est enfin possible que le PEG permette de limiter les lésions tissulaires du greffon en réduisant l'importance des lésions endothéliales comme l'ont montré un certain nombre d'auteurs [8, 10, 12].

Chez le rat ex vivo et dans un modèle in vivo d'auto transplantation rénale chez le porc, nous avons pu montrer que IGL-1 permettait d'améliorer de façon significative les fonctions tubulaires, et glomérulaire avec de meilleures reprises de la fonction rénale in vivo et de meilleures clairances de la créatinine à J7 lorsque IGL-1 est comparé à UW qui reste jusqu'à aujourd'hui le liquide de conservation de référence en transplantation rénale. L'amélioration des fonctions tubulaires serait liée au caractère extracellulaire de la solution de conservation qui permet de maintenir le stock de Na-K ATPase et de diminuer la vasoconstriction tissulaire en limitant la pénétration de calcium dans les cellules [31]. Ces faits ont déjà été démontrés par d'autres équipes [14] et pour d'autres organes tels que le foie où les lésions sinusoidales et hépatocellulaires sont moins marquées lorsque la solution de conservation utilisée est riche en sodium et pauvre en potassium [3]. Comme des résultats cliniques préliminaires non publiés semblent le montrer, IGL-1 parait également donner de meilleures reprises de fonction rénales que UW avec de meilleures clairances de créatinine et un taux de dialyse post transplantation plus faible. L'utilisation de IGL-1 est caractérisée sur le plan histologique chez le porc par la présence d'une infiltration cellulaire mononuclée du rein moins dense, par une expression interstitielle atténuée des marqueurs de fibrose, par une diminution des marqueurs d'apoptose et par une diminution de l'expression du CHM II. Il est probable que la diminution des signes inflammatoires soit au moins en partie liée à une diminution de la péroxydation lipidique [20]. La réduction de l'expression du CMH II serait partiellement liée à la modulation des phénomènes inflammatoires et pourrait être corrélée à l'effet d'immunocamouflage des PEG décrit précédemment et qui est en cours d'étude pour IGL-1. Cette réduction de l'expression du CMH II s'accompagnerait, comme l'ont montré d'autres auteurs [5, 6, 9], d'une diminution de l'expression de VCAM-1 et de l'infiltration tissulaire par les CD4+ mais également d'une réduction des lésions de fibrose interstitielle. Sur le plan purement immunologique, l'immunocamouflage pourrait avoir un intérêt capital dans la modulation de la réponse allo immune au moment de la greffe et les conséquences sur l'incidence clinique des rejets aigus et chroniques est en cours d'évaluation. L'étude de l'expression des marqueurs de fibrose nous a permis de caractériser une diminution de l'a-SMA chez le porc ; cette étude sera particulièrement intéressante chez l'homme puisqu'il a déjà été prouvé que sur des biopsies effectuées à J0 il existait une corrélation inverse entre expression de ce marqueur de fibrose et survie des greffons [1, 19].

Sans qu'il soit possible d'entrer dans les détails, il est important de noter que les résultats que nous avons présentés pour le rein sont de même nature en transplantation hépatique [2], ce qui fait de IGL-1 une solution utilisable dans les prélèvements multi organes abdominaux.

CONCLUSIONS

IGL-1 doit être considérée comme une solution de conservation de nouvelle génération. Elle est actuellement la seule solution de type extracellulaire qui utilise comme colloide un Polyéthylène Glycol de 35000 Daltons et dont les résultats pré-cliniques aient été validés en transplantation rénale et hépatique. Les résultats expérimentaux en transplantation rénale démontrent une infériorité de UW puisque IGL-1 donne des reprises de fonction rénale significativement meilleures que UW. Ces résultats remettent en cause le fait que UW doive toujours être considérée comme la solution de conservation de référence. Une étude clinique en cours devrait pouvoir répondre à cette question. Outre l'amélioration de la reprise de fonction rénale, la présence d'un PEG dans IGL-1 pourrait, par son effet d'immunocamouflage, améliorer la tolérance immunitaire du greffon et limiter la survenue des épisodes de rejet. Un certain nombre de travaux expérimentaux sont actuellement en cours et devraient permettre d'approcher une réponse qui ne sera, là encore, donnée que par la réalisation d'une étude clinique complémentaire que nous allons également mettre en oeuvre.

ABREVIATIONS

CMH : Complexe majeur d'histocompatibilité

GFR : Débit de filtration glomérulaire

FRNa : Fraction de réabsorption du sodium

HES : Hydroxyéthyl amidon

IR : Ischémie Reperfusion

PEG : Polyéthylène Glycol

UW : University Wisconsin Solution ou Belzer

Remerciements

Nous remercions le Pr Barnengo pour son aide dans la réalisation de l'analyse quantimétrique des coupes histologiques (Service de Quantimétrie et de Microscopie Confocale, Domaine Rockefeller, Lyon).

Références

1. Badid C., Desmouliere A., Babici D., Hadj-Aissa A., McGregor B., Lefrancois N., Touraine J.L., Laville M. : Interstitial expression of alpha-SMA : an early marker of chronic renal allograft dysfunction. Nephrol. Dial. Transplant., 2002 ; 1993-1998.

2. Ben Abdennebi H., Steghens J.P., Hadj-Aissa A., Barbieux A., Ramella-Virieux S., Gharib C., Boillot O. : A preservation solution with polyethylene glycol and calcium: a possible multiorgan liquid. Transpl. Int., 2002 ; 348-354.

3. Ben Abdennebi H., Steghens J.P., Margonari J., Ramella-Virieux S., Barbieux A., Boillot O. : High-Na+ low-K+ UW cold storage solution reduces reperfusion injuries of the rat liver graft. Transpl. Int., 1998 ; 223-230.

4. Collins G.M., Wicomb W.N., Levin B.S., Verma S., Avery J., Hill J.D. : Heart preservation solution containing polyethyleneglycol: an immunosuppressive effect ? Lancet, 1991 ; 890-891.

5. Daemen M.A., de Vries B., Buurman W.A. : Apoptosis and inflammation in renal reperfusion injury. Transplantation, 2002 ; 1693-1700.

6. Dragun D., Hoff U., Park J.K., Qun Y., Schneider W., Luft F.C., Haller H. : Ischemia-reperfusion injury in renal transplantation is independent of the immunologic background. Kidney Int., 2000 ; 2166-2177.

7. Eugene M. : Polyethyleneglycols and immunocamouflage of the cells tissues and organs for transplantation. Cell Mol. Biol., 2004 ; 209-215.

8. Faure J.P., Hauet T., Han Z., Goujon J.M., Petit I., Mauco G., Eugene M., Carretier M., Papadopoulos V. : Polyethylene glycol reduces early and long-term cold ischemia-reperfusion and renal medulla injury. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002 ; 861-870.

9. Gibelin H., Hauet T., Eugene M., Essique D., Levillain P., Carretier M. : Beneficial effects of addition of polyethylene glycol to extracellular type solutions to minimize ischemia/reperfusion injuries in an isolated-perfused rat liver model. Transplant. Proc., 2002 ; 768.

10. Goujon J.M., Vandewalle A., Baumert H., Carretier M., Hauet T. : Influence of cold-storage conditions on renal function of autotransplanted large pig kidneys. Kidney Int., 2000 ; 838-850.

11. Hauet T., Baumert H., Amor I.B., Goujon J.M., Gibelin H., Godart C., Vandewalle A., Carretier M., Eugene M. : Protection of autotransplanted pig kidneys from ischemia-reperfusion injury by polyethylene glycol. Transplantation, 2000 ; 1569-1575.

12. Hauet T., Baumert H., Faure J.P., Bardou A., Beguinot S., Gibelin H., Ben A.I., Germonville T., Caritez J.C., Carretier M., Eugene M. : Beneficial effects of low-potassium and polyethylene glycol solution on renal lipid peroxidation during 48-hour cold storage and normothermic reperfusion. Transplant. Proc., 1998 ; 2798-2799.

13. Hauet T., Goujon J.M., Baumert H., Petit I., Carretier M., Eugene M., Vandewalle A. : Polyethylene glycol reduces the inflammatory injury due to cold ischemia/reperfusion in autotransplanted pig kidneys. Kidney Int., 2002 ; 654-66.

14. Hauet T., Han Z., Doucet C., Ramella-Virieux S., Hadj A.A., Carretier M., Papadopoulos V. : A modified University of Wisconsin preservation solution with high-NA+ low-K+ content reduces reperfusion injury of the pig kidney graft. Transplantation, 2003 ; 18-27.

15. Howden B.O., Jablonski P., Thomas A.C., Walls K., Biguzas M., Scott D.F., Grossman H., Marshall V.C. : Liver preservation with UW solution. I. Evidence that hydroxyethyl starch is not essential. Transplantation, 1990 ; 869-872.

16. Itasaka H., Burns W., Wicomb W.N., Egawa H., Collins G., Esquivel C.O. : Modification of rejection by polyethylene glycol in small bowel transplantation. Transplantation, 1994 ; 645-648.

17. Jayle C., Hauet T., Menet E., Hebrard W., Hameury F., Eugene M., Carretier M., Corbi P. : Beneficial effects of polyethylene glycol combined with low-potassium solution against lung ischemia/reperfusion injury in an isolated, perfused, functional pig lung. Transplant. Proc., 2002 ; 834-835.

18. Lieberthal W., Koh J.S., Levine J.S. : Necrosis and apoptosis in acute renal failure. Semin. Nephrol., 1998 ; 505-518.

19. Lu C.Y., Penfield J.G., Kielar M.L., Vazquez M.A., Jeyarajah D.R. : Hypothesis : is renal allograft rejection initiated by the response to injury sustained during the transplant process ? Kidney Int., 1999 ; 2157-2168.

20. Mack J.E., Kerr J.A., Vreugdenhil P.K., Belzer F.O., Southard J.H. : Effect of polyethylene glycol on lipid peroxidation in cold-stored rat hepatocytes. Cryobiology, 1991 ; 1-7.

21. Morariu A.M., Vd P.A., Oeveren V., 'T Hart N.A., Leuvenink H.G., Graaff R., Ploeg R.J., Rakhorst G. : Hyperaggregating effect of hydroxyethyl starch components and University of Wisconsin solution on human red blood cells : a risk of impaired graft perfusion in organ procurement ? Transplantation, 2003 ; 37-43.

22. Ojo A.O., Wolfe R.A., Held P.J., Port F.K., Schmouder R.L. : Delayed graft function : risk factors and implications for renal allograft survival. Transplantation, 1997 ; 968-974.

23. Ploeg R.J., van Bockel J.H., Langendijk P.T., Groenewegen M., van der Woude F.J., Persijn G.G., Thorogood J., Hermans J. : Effect of preservation solution on results of cadaveric kidney transplantation. The European Multicentre Study Group. Lancet, 1992 ; 129-137.

24. Poston R.N., Haskard D.O., Coucher J.R., Gall N.P., Johnson-Tidey R.R. : Expression of intercellular adhesion molecule-1 in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol., 1992 ; 665-673.

25. Prochazkova J., Kylarova D., Vranka P., Lichnovsky V. : Comparative study of apoptosis-detecting techniques : TUNEL, apostain, and lamin B. Biotechniques, 2003 ; 528-534.

26. Ramella S.G., Hadj-Aissa A., Barbieux A., Steghens J.P., Colpart J.J., Zech P., Pozet N. : Evaluation of a high sodium-low potassium cold-storage solution by the isolated perfused rat kidney technique. Nephrol. Dial. Transplant., 1995 ; 842-846.

27. Roels L., Coosemans W., Donck J., Maes B., Peeters J., Vanwalleghem J., Pirenne J., Vanrenterghem Y. : Inferior outcome of cadaveric kidneys preserved for more than 24 hr in histidine-tryptophan-ketoglutarate solution. Leuven Collaborative Group for Transplantation. Transplantation, 1998 ; 1660-1664.

28. Takada M., Chandraker A., Nadeau K.C., Sayegh M.H., Tilney N.L. : The role of the B7 costimulatory pathway in experimental cold ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest., 1997 ; 1199-1203.

29. Tokunaga Y., Wicomb W.N., Garcia-Kennedy R., Esquivel C.O., Collins G.M. : The immunosuppressive effect of polyethylene glycol in a flush solution for rat liver transplantation. Transplantation, 1992 ; 756-758.

30. Troppmann C., Gillingham K.J., Benedetti E., Almond P.S., Gruessner R.W., Najarian J.S., Matas A.J. : Delayed graft function, acute rejection, and outcome after cadaver renal transplantation. The multivariate analysis. Transplantation, 1995 ; 962-968.

31. van der Hoeven J.A., de Jong L.J., Wolf R.F., Kamman R.L., Ploeg R.J. : Tissue hydration in kidneys during preservation: a relaxometric analysis of time-dependent differences between cortex and medulla. Transpl. Int., 1996 ; S452-S454.

32. Vreugdenhil P.K., Marsh D.C., Belzer F.O., Southard J.H. : Urea and protein synthesis in cold-preserved isolated rat hepatocytes. Hepatology, 1992 ; 241-246.

33. Wahlberg J.A., Love R., Landegaard L., Southard J.H., Belzer F.O. : 72-hour preservation of the canine pancreas. Transplantation, 1987 ; 5-8.

34. Zheng T.L., Lanza R.P., Soon-Shiong P. : Prolonged pancreas preservation using a simplified UW solution containing polyethylene glycol. Transplantatio, 1991 ; 63-66.