Étude préliminaire des mutations des gènes p53 et FGFR3 sur le culot urinaire des tumeurs de la vessie

25 janvier 2013

Auteurs : N. Noël, J. Couteau, G. Maillet, F. Gobet, F. d'Aloisio, C. Minier, C. Pfister
Référence : Prog Urol, 2013, 1, 23, 29-35




 




Introduction


En France, le carcinome vésical concerne environ 10000 nouveaux patients par an (cinquième cancer le plus fréquent) et est responsable de 3 % des décès par cancer. L’âge moyen de survenu est de 65ans [1]. On distingue les tumeurs de vessie n’infiltrant pas le muscle (TVNIM) : tumeurs Ta, T1 et CIS et les tumeurs de vessie infiltrant le muscle (TVIM) : T2, T3 et T4. Les tumeurs de vessie sont également classées selon le grade cellulaire qui définit leur agressivité : G1 (peu agressif) à G3 (très agressif). On estime que plus de 50 % des TVNIM récidivent à un an [2]. Les patients aux antécédents de tumeur vésicale sont donc étroitement surveillés par cystoscopie et cytologies urinaires à trois, six et 12 mois selon les recommandations de l’association française d’urologie [3]. Cependant, ces deux examens ont des limites : faible sensibilité pour la cytologie urinaire, notamment pour détecter les tumeurs de bas grade, infections urinaires et sténoses urétrales pour la cystoscopie.


À ce jour, différents tests urinaires ont été commercialisés : Nuclear Matrix Protein 22 (NMP22), Bladder Tumor Antigen (BTA), Immunocyt… Si leur sensibilité est meilleure que celle de la cytologie urinaire pour la détection des tumeurs vésicales, c’est le plus souvent au dépens d’une moins bonne spécificité et de l’existence de nombreux faux-positifs [4]. Le développement d’une nouvelle méthode non invasive, peu coûteuse, simple et fiable pour détecter dans les urines la présence d’une tumeur de vessie, demeure un enjeu important.


Notre projet de recherche, qui fait l’objet d’une collaboration entre le CHU de Rouen et la société Toxem, financé par la région Haute-Normandie et le Fond européen de développement régional (FEDER), repose sur l’étude de marqueurs génétiques des tumeurs de la vessie dans les culots urinaires. Les travaux de biologie moléculaire ayant suggéré l’existence de deux voies majeures dans la cancérogenèse vésicale : l’une pour les tumeurs infiltrantes et/ou à haut risque de malignité caractérisée par la présence de mutations du gène suppresseur de tumeur p53 , l’autre pour les tumeurs non infiltrantes et/ou à faible risque de malignité caractérisée par des mutations du gène Fibroblast Growth Factor Receptor 3 (FGFR3 ). En pratique, il semble au vue des données de la littérature que 80 % des tumeurs vésicales expriment au moins une de ces deux mutations [5, 6].


Notre objectif était de présenter les résultats préliminaires de la recherche des mutations de p53  et FGFR3  dans les urines et leur concordance avec les mutations observées dans les tumeurs vésicales diagnostiquées de façon concomitante.


Patients et méthodes


Prélèvements et préparation des échantillons


Une résection transurétrale de vessie (RTUV) a été réalisée au CHU de Rouen entre janvier 2011 et janvier 2012 pour les 50 patients étudiés. Dans tous les cas, un prélèvement d’urine été pratiqué lors de la cystoscopie avant l’intervention. Ces échantillons urinaires ont été conservés à 4°C dans un flacon contenant un tampon (666g/L de thiocyanate de guanidium, 17,1g de n-Lauroylsarcosine, 0,05mol/L d’acétate de sodium, 0,007 % de ß-mercapto-éthanol) [7, 8]. L’analyse histologique du tissu prélevé a toujours confirmé l’origine tumorale conduisant à la conservation en tumorothèque (service d’anatomopathologie). Les culots urinaires prélevés ont été préparés au centre d’investigation clinique (CIC) du CHU de Rouen (centrifugation pendant dix minutes à 10 000g à 4°C, puis à 15000g pendant dix minutes à 4°C), le surnageant a été éliminé et le culot conservé à –80°C. Tous les patients sélectionnés ont reçu une information claire, loyale et appropriée et ont signé une autorisation écrite conforme aux recommandations de l’Agence nationale de sécurité du médicament (ANSM) qui a donné son autorisation pour la réalisation de cette étude.


Extraction et amplification des acides nucléiques


L’extraction d’ARNm, nécessaire pour la recherche des mutations du gène p53 , dans les tumeurs et les culots urinaires, a été réalisée selon le protocole du kit « Illustra QuickPrep Micro mRNA Purification » de GE Healthcare. Après centrifugation (11000g pendant une minute), la résine était conservée car contenant l’ARNm et le surnageant a été récupéré pour obtenir l’ADN génomique (ADNg). Après élution, les ARNm ont été conservés à –80°C. Les ADNc étant ensuite obtenu par rétrotranscription (Kit Verso, Thermo Scientific). L’ADNc du gène p53  a été amplifié par PCR en utilisant une polymérase haute-fidélité (PrimeStar, TaKaRa) et les amorces P3 (5′-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAA-3′) et P4 (5′-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGT-3′).


L’extraction d’ADNg des tumeurs et culots urinaires, nécessaire à la recherche des mutations de FGFR3 , a été réalisée en suivant le protocole du Kit « QIAamp Viral RNA » de Qiagen. Après élution, l’ADNg était conservé à –20°C. Les trois exons d’intérêt (7, 10 et 15) sur lesquels sont localisées les huit mutations recherchées, ont été amplifié par PCR (Multiplex PCR Kit de Qiagen).


Recherche des mutations de p53  et FGFR3


Les mutations de p53  ont été détectées par le Functionnal Analysis of Separated Allele in Yeast (FASAY) (Figure 1), qui permet d’évaluer l’intégrité du gène p53  par l’étude de la fonctionnalité de sa protéine dans un organisme eucaryote, la levure Saccharomyces cerevisiae [9, 10]. Cette souche possède une seule copie fonctionnelle du gène indicateur ade2  dont l’expression est sous le contrôle de la protéine P53 (un élément de réponse à P53 a été placé dans le promoteur du gène ade2 ). L’activation du gène ade2  permet la synthèse d’adénine nécessaire à la croissance des levures et leur permet donc de pousser sur un milieu carencé en adénine. Ainsi, les colonies de levures exprimant une protéine P53 sauvage sont blanches alors que les colonies qui expriment une protéine P53 mutée sont rouges. Cette couleur rouge résulte d’une accumulation de produits intermédiaires du métabolisme de l’adénine.


Figure 1
Figure 1. 

Technique du FASAY. La levure Saccharomyces cerevisiae possède une seule copie fonctionnelle du gène indicateur ade2  dont l’expression est sous le contrôle de la protéine P53 (un élément de réponse à P53 a été placé dans le promoteur du gène ade2 ). Les colonies de levure exprimant p53  sauvage sont blanches alors que les colonies qui expriment p53  muté sont rouges. Cette couleur rouge résulte d’une accumulation de produits intermédiaires du métabolisme de l’adénine.




Pour la recherche des mutations de FGFR3 , nous avons utilisé le Single Nucleotide analysed Polymorphysm (SNaPshot), qui est une réaction d’extension d’amorces permettant de détecter les huit mutations ponctuelles, « hotspot », les plus fréquentes de ce gène, localisées sur trois exons : deux mutations sur l’exon 7, deux sur l’exon 10 et quatre sur l’exon 15 [11]. Les échantillons ont été analysés par le séquenceur du service d’anatomopathologie (3130xl Genetic Analyzer d’Applied Biosystems) du CHU de Rouen.


Résultats


Au total, 50 couples tumeur/culot urinaire ont été analysés. Pour 49 couples, les mutations de FGFR3  ont été recherchées sur l’ADNg. La recherche des mutations de p53  a été réalisée pour 37 couples, l’extraction de l’ARNm n’ayant été possible chez 13 patients. La recherche des mutations de p53  et FGFR3  a ainsi été réalisée pour 36 couples tumeur/culot urinaire.


Mutations de p53


Une recherche des mutations de p53  a été réalisée pour un total de 37 tumeurs et culots urinaires correspondants. L’analyse anatomopathologique du stade TNM des lésions vésicales a mis en évidence 24 TVNIM : Ta (54 %), T1 (11 %). Dans sept cas, il était noté une infiltration du muscle vésical : T2 (19 %) alors que dans six cas existait un CIS (16 %). La répartition des tumeurs en fonction du grade cellulaire était la suivante : deux cas G1 (5 %), dix cas G2 (27 %) et 25 cas G3 (68 %). Une mutation de p53  existait pour 18 tumeurs : 45 % Ta, 50 % des T1, 57 % des T2 et 50 % des CIS (Figure 2A). Si aucune tumeur de faible grade G1 ne présentait de mutation de p53 , 50 % des G2 et 52 % des G3 étaient mutées (Figure 2B). Au total, il n’existait pas de différence significative dans la répartition des mutations selon le stade (p =0,95) et le grade (p =0,62) des tumeurs.


Figure 2
Figure 2. 

Répartition du taux de mutations de p53  dans les tumeurs vésicales selon leur stade (A) et leur grade (B). Il n’existe pas de différence significative dans la répartition du taux de mutation dans les tumeurs selon le stade (p =0,95) et le grade (p =0,62). Répartition du taux de mutation de p53  dans les culots urinaires selon le stade (C) et grade (D) des tumeurs correspondantes. Il n’existe pas de différence significative dans la répartition du taux de mutation dans les culots urinaires selon le stade (p =0,11) et le grade (p =0,19) des tumeurs correspondantes.




Lors de l’analyse du culot urinaire porteurs, une mutation de p53  était détectée dans 11 cas : 15 % des tumeurs correspondantes Ta, 50 % des tumeurs T1, 37 % des tumeurs T2 et 60 % des cas de CIS (Figure 2C). Le culot urinaire muté pour p53  était observé pour 10 % des tumeurs correspondantes G2 et 40 % des tumeurs correspondantes G3 (Figure 2D). Il n’existait pas de différence significative dans la répartition des mutations selon le stade tumoral (p =0,11) et le grade cellulaire (p =0,62) des tumeurs correspondantes. Ainsi, les mutations de p53  présentes dans les 18 tumeurs ont été mises en évidence dans neuf culots urinaires correspondants, soit une sensibilité de 50 %. Il existait un culot urinaire sauvage pour p53  pour 17 des 19 tumeurs possédant un p53  sauvage, soit une spécificité de 89,5 %. La valeur prédictive positive était de 81,8 % et la valeur prédictive négative de 65,4 % (Figure 4A).


Mutations de FGFR3


La recherche des mutations de FGFR3  a été réalisée pour un total de 49 tumeurs et culots urinaires correspondants. La distribution histologique de ces tumeurs était la suivante : 29 TVNIM : Ta (47 %), T1 (12,2 %), 13 TVIM (26,5 %) et sept cas de CIS (14,3 %). L’analyse du grade cellulaire a mis en évidence 4 tumeurs G1 (8 %), 11 tumeurs G2 (27 %) et 34 tumeurs G3 (68 %). Dans 12 cas, une mutation de FGFR3  était détectée : 40 % des tumeurs Ta, 17 % des tumeurs T1 et 18 % des tumeurs T2. À noter qu’il n’existait aucun cas mutation de FGFR3  dans les CIS vésicaux (Figure 3A). Une mutation de FGFR3  était présente dans 75 % des tumeurs G1, 36 % des tumeurs G2 et 17 % des tumeurs G3 (Figure 3B). Il existait donc une différence significative dans la répartition des mutations selon le grade cellulaire (p =0,01), non retrouvée pour le stade tumoral (p =0,151).


Figure 3
Figure 3. 

Répartition du taux de mutations de FGFR3  dans les tumeurs vésicales selon leur stade (A) et leur grade (B). Il existe différence significative dans la répartition du taux de mutation dans les tumeurs selon le grade (p =0,01) mais pas selon le stade (p =0,151). Répartition du taux de mutation de FGFR3  dans les culots urinaires selon le stade (C) et grade (D) des tumeurs correspondantes. Il n’existe pas de différence significative dans la répartition du taux de mutation dans les culots urinaires selon le stade (p =0,35) et le grade (p =0,33) des tumeurs correspondantes.




L’analyse du culot urinaire a permis de détecter huit cas de mutation de FGFR3 : 22 % des tumeurs correspondantes Ta, 17 % des tumeurs T1, 22 % des tumeurs T2 et aucun CIS vésical (Figure 3C). Il existait un culot urinaire muté pour 25 % des tumeurs G1, 27 % des tumeurs G2 et 12 % des tumeurs G3 (Figure 3D). Il n’a pas été observé de différence significative dans la répartition des mutations selon le stade tumoral (p =0,35) et le grade cellulaire (p =0,33) des tumeurs. Les mutations de FGFR3  présentes dans les 12 tumeurs ont été observées dans sept culots urinaires correspondants, soit une sensibilité de 58,3 %. Le culot urinaire était sauvage pour FGFR3  dans 36 des 37 tumeurs ayant un gène FGFR3  sauvage, soit une spécificité de 97,3 %. La valeur prédictive positive est de 87,5 % et la valeur prédictive négative de 87,8 % (Figure 4B).


Figure 4
Figure 4. 

A. Concordance tumeurs/urines pour les mutations de p53  chez 37 patients. La sensibilité est de 50 %, la spécificité de 89,5 %, la valeur prédictive positive de et la valeur prédictive négative de 65,4 %. B. Concordance tumeurs/urines pour les mutations de FGFR3  chez 49 patients. La sensibilité est de 58,3 %, la spécificité de 97,3 %, la valeur prédictive positive de 87,5 % et la valeur prédictive négative de 87,8 %. C. Concordance tumeurs/urines pour les mutations de FGFR3  et/ou p53  chez 36 patients. La sensibilité est de 62,5 %, la spécificité de 91,6 %, la valeur prédictive positive de 93,7 % et la valeur prédictive négative de 55 %.




Analyse de la concordance du phénotype p53-FGFR3  entre la tumeur vésicale et le culot urinaire


Dans notre étude, nous avons étudié les mutations de p53  et de FGFR3  pour 36 couples tumeur/culot urinaire. Il existait au moins une des deux mutations dans la tumeur chez 24 patients (66 % des cas) et dans le culot urinaire chez 17 patients (48,5 % des cas). Nous avons regroupé toutes les tumeurs porteuses au minimum d’une des deux mutations. Les cellules du culot urinaire correspondant étaient considérées comme mutées lorsque la mutation de p53  et/ou FGFR3  était celle observée dans la tumeur vésicale. Ainsi, les mutations de p53  et/ou FGFR3  présentes dans 24 tumeurs ont été mises en évidence dans 15 culots urinaires correspondants, soit une sensibilité de 62,5 %. Le culot urinaire était sauvage pour ces deux gènes dans 11 des 12 tumeurs sauvages pour FGFR3  et p53 , soit une spécificité de 97,3 %. La valeur prédictive positive est de 93,7 % et la valeur prédictive négative de 55 % (Figure 4C).


Discussion


À notre connaissance, ce travail de recherche constitue la première étude recherchant les mutations des gènes p53  et FGFR3  chez un même patient sur la tumeur vésicale et les cellules du culot urinaire. Si rechercher les mutations de FGFR3  dans les urines semble avoir un intérêt dans la détection des TVNIM de faible grade, rechercher les mutations de p53  répond à deux objectifs : détecter les tumeurs invasives agressives mais aussi détecter l’apparition ou la récidive de CIS vésical. Rechercher les mutations de p53  et FGFR3  dans les urines nécessite d’extraire l’ADN et l’ARNm à partir des cellules contenues dans les urines. Le tampon de thyocyanate de guanidium a initialement été mis au point pour conserver l’ARNm, très fragile. Dans notre étude, tous les acides nucléiques (ADNg et ARNm) ont été extraits à partir d’un seul échantillon d’urine conservé dans ce tampon, permettant de simplifier le prélèvement initial d’urine.


Concernant la recherche des mutations de p53  dans les tumeurs, il existait une mutation fonctionnelle dans 45 % des tumeurs Ta, 50 % des tumeurs T1, 57 % des tumeurs T2 et 50 % des cas de CIS, sans différence statistiquement significative, contrairement aux données de la littérature. Bakkar et al. par séquençage de 81 tumeurs [5], et Lamy et al. par FASAY sur 121 tumeurs [12], observaient en effet une différence significative dans la répartition des mutations de p53  dans les tumeurs, plus fréquentes pour les tumeurs invasives et de haut grade cellulaire. Le faible effectif de notre étude est susceptible d’expliquer cette discordance. Pour la recherche des mutations de p53  dans les urines, la sensibilité, c’est-à-dire la probabilité de retrouver dans l’urine la mutation existante dans la tumeur vésicale, était de 50 %. Ces résultats sont dans la moyenne de ceux, très disparates, décrits dans la littérature : sensibilité de 37 % pour Eissa et al. chez 100 patients par séquençage [13], mais de 87 % pour Prescott et al. par séquençage chez 49 patients [14].


Concernant la recherche des mutations de FGFR3 , nous avons observé un taux de tumeurs mutées de 40 % pour les stades Ta, 17 % pour les stades T1, 18 % pour les stades T2, sans aucun cas de carcinome in situ vésical sur les 49 tumeurs étudiées. Pas de différence significative dans la répartition des mutations de FGFR3  selon le stade tumoral mais les mutations de FGFR3  semblaient être plus fréquentes pour les tumeurs Ta. En revanche, notion d’une différence significative dans la répartition des mutations de FGFR3  en fonction du grade cellulaire. Les mutations de FGFR3  ont été observées lorsque le grade cellulaire était faible et semblaient dominer dans les TVNIM peu agressives. Ces données sont bien retrouvées dans la littérature : Billerey et al. [15] et Van Rhijn et al. [6]. Pour la recherche des mutations de FGFR3  dans les urines, la sensibilité, c’est-à-dire la probabilité de retrouver dans l’urine la même mutation que dans la tumeur de vessie, était de 58,33 %. Nos résultats sont proches de ceux initialement publiés avec la technique de SNaPshot : sensibilité de 62 % pour van Oers et al. [11] et de 58 % pour Zuiverloon et al. [16]. La spécificité du test recherchant les mutations de FGFR3  dans les urines était excellente (97,3 %).


Au total, dans notre étude, la tumeur et le culot urinaire correspondant ont été analysés à la recherche de mutation de p53  et de FGFR3  chez 36 patients. Nous avons observé au moins une des deux mutations dans la tumeur chez 24 patients (66 %) et dans le culot urinaire chez 17 patients (48,5 %). La probabilité de retrouver dans les urines une mutation existant dans la tumeur était de 62,5 %, ce qui demeure faible pour un test de dépistage. La spécificité était, en revanche, très bonne (91,7 %) avec un très faible nombre de faux-positifs (valeur prédictive positive de 93,7 %).


Actuellement, la cytologie urinaire est le seul test urinaire recommandé dans le diagnostic et la surveillance des tumeurs de vessie. Si sa spécificité est bonne (80 à 100 % selon les études), de même que sa sensibilité pour les tumeurs de haut grade ou les CIS, la sensibilité pour les tumeurs de faible grade est faible (20 %). Ces résultats sont assez variables dans la littérature, dépendant en grande partie de l’expérience du pathologiste. D’autres tests urinaires ont été commercialisés mais aucun n’est encore recommandé en pratique courante par le comité de cancérologie de l’association française d’urologie (CCAFU). Campos-Fernandes et al. ont réalisé une revue de la littérature des caractéristiques de ces différents tests [17]. Le NMP22 (dosage quantitatif immuno-enzymatique de la matrice nucléaire) a une sensibilité moyenne de 66 % mais sa spécificité reste bien inférieure à celle de la cytologie urinaire avec un taux de faux-positifs d’environ 25 % (cystites, lithiases). Le BTA test (dosage qualitatif [BTA Stat] et quantitatif [BTA TRAK] du human complement facture H-related protein ) a une sensibilité moyenne de 64 % pour le BTA Stat et comprise entre 56 et 74 % pour le BTA TRAK. La spécificité moyenne est de 73 % pour le BTA Stat et de 71 % pour le BTA TRAK. L’Immunocyt/uCyt a une sensibilité entre 72 et 100 % lorsqu’elle est couplée avec les cytologies urinaires. La spécificité est de 61 à 82 %. Ce test reste inférieur à la cytologie urinaire pour les faux-positifs.


Le bio-assay développé dans notre étude, recherchant les mutations de p53  et FGFR3  dans les urines, a une sensibilité de 62,5 % et une spécificité de 97,3 %. Si la sensibilité reste faible pour un test de dépistage, elle est cependant supérieure à celle de la cytologie urinaire, en particulier pour la détection des TVNIM de faible grade. La spécificité est excellente, semblable à celle de la cytologie urinaire. De plus, l’excellente valeur prédictive positive (93,7 %) semble réduire fortement les faux-positifs, principal défaut des tests urinaires décrits auparavant.


Conclusion


Les résultats préliminaires de notre étude ont démontré que la recherche simultanée des mutations de p53  er FGFR3  dans les urines, par un bio-assay fiable et reproductible, semblait supérieure à la cytologie urinaire. Ces données doivent être confirmées par la poursuite de notre travail de recherche sur un nombre plus important de patients. L’indication de notre bio-assay en association avec la cytologie urinaire était intéressante pour la détection des tumeurs de vessie, en augmentant la sensibilité tout en gardant une spécificité élevée et un faible nombre de faux-positifs.


Les résultats encourageants de cette étude préliminaire vont nous amener à poursuivre notre projet de recherche par l’analyse des culots urinaires de patients connus pour TVNIM en surveillance avec des cytologies urinaires et une fibroscopie vésicale, mais également dans le dépistage d’une population à risque avec exposition professionnelle (respectivement cohorte II et III dans le cadre du projet FEDER qui a financé cette étude).


Déclaration d’intérêts


Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. Travail de recherche bénéficiant d’un financement FEDER 2011.



 Niveau de preuve : 3.




Références



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