Étude de l'expression des kinases Aurora dans le carcinome à cellules rénales

25 décembre 2010

Auteurs : R. Mathieu, J.-J. Patard, N. Stock, N. Rioux-Leclercq, F. Guillé, P. Fergelot, K. Bensalah
Référence : Prog Urol, 2010, 13, 20, 1200-1205




 




Introduction


Le carcinome à cellules rénales (CCR) représente 3 % des tumeurs solides et son incidence augmente régulièrement [1]. Plusieurs facteurs pronostiques, comme le stade, le grade tumoral ou un Eastern Cooperative Oncology Group Study performance score (score ECOG) altéré, sont bien établis. Au stade métastatique, les patients ont un taux de survie à cinq ans de moins de 10 % [2]. Les options thérapeutiques sont relativement limitées en cas de CCR métastatique : la radiothérapie et la chimiothérapie sont inefficaces et l’immunothérapie, avec l’interféron et l’interleukine, ne confère qu’une réponse limitée au prix d’une toxicité significative [3]. De nouvelles thérapies, dites ciblées, ont mis en évidence des résultats encourageants avec des taux de réponse pouvant atteindre plus de 40 %. Cependant, le gain de survie reste limité à un peu plus de quatre mois lorsqu’il existe [4]. Il apparaît donc nécessaire de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans les cancers rénaux agressifs, afin de mieux contrôler leur évolution et optimiser leur prise en charge.

La famille des kinases Aurora (Aurora A, B, et C) a un rôle primordial dans la régulation de la division cellulaire (Figure 1) en contrôlant notamment la ségrégation chromatidienne durant la mitose [5]. Plusieurs études ont établi qu’Aurora A et B sont surexprimées dans des lignées cellulaires et des échantillons tissulaires de cancers humains [6, 7, 8, 9]. Le gène Aurora A est localisé sur le bras court du chromosome 20 (20q13), dans une région souvent amplifiée dans les cancers épithéliaux [6], et peut ainsi être considéré comme un proto-oncogène. Aurora B semble impliqué dans la division cytoplasmique [10]. La fonction exacte d’Aurora C reste imprécise.


Figure 1
Figure 1. 

Rôle des kinases Aurora A et B dans la mitose.




Des essais précliniques et cliniques sont actuellement en cours afin d’étudier l’efficacité d’inhibiteurs des kinases Aurora dans le traitement de différents cancers [11]. Le but de ce travail était d’étudier l’expression des gènes Aurora A et B , mesurée par PCR, dans les CCR et son association avec les paramètres cliniques et pathologiques usuels à partir d’échantillons congelés provenant de patients opérés pour une tumeur rénale.


Patients et méthodes


Patients et échantillons tumoraux


L’étude a été entreprise avec l’accord et sous le contrôle du comité de surveillance de notre établissement, après consentement éclairé de chaque patient. Elle a consisté en l’étude rétrospective des données de 40 patients traités pour CCR dans notre établissement entre mars 2003 et janvier 2006, pour lesquels des échantillons tumoraux congelés de bonne qualité étaient disponibles. Tous les patients avaient été opérés d’une néphrectomie totale ou partielle. Le curage ganglionnaire était limité aux ganglions pédiculaires et latérocaves ou latéro-aortiques directement adjacents. Un curage extensif (de la bifurcation aortique au diaphragme) était réalisé en cas de suspicion d’atteinte macroscopique sur l’imagerie préopératoire (adénopathie dont le diamètre était supérieur à 1cm).

Le tissu tumoral frais était obtenu immédiatement après exérèse chirurgicale. Deux échantillons étaient prélevés (un provenant de la tumeur, l’autre du parenchyme rénal sain) et immédiatement congelés dans l’azote liquide, puis stockés à −80°C.

Les patients ont été suivis tous les six mois par un examen clinique, une échographie abdominale, une radiographie pulmonaire et un bilan sanguin. Les données suivantes ont été collectées et rentrées dans une base de données informatique : sexe, age, score ECOG, taille tumorale, histologie, stade tumoral (classification TNM de 2002), grade tumoral selon Furhman, présence de métastases ganglionnaires ou à distance et durée du suivi.

Dans cette étude, nous n’avons pris en compte que les échantillons tumoraux, car nous savions, par de précédentes analyses effectuées dans notre laboratoire, que nos échantillons de parenchyme rénal sain avaient une qualité d’ARN médiocre (données non publiées).


Extraction d’ARN total


Après homogénéisation, l’ARN total était extrait en utilisant le GenElute Mammalian Total RNA Kit (Sigma®, Saint-Louis, États-Unis). Le lysat était rapidement filtré au moyen d’une colonne de filtration. Une DNase était ajoutée au mélange afin d’éviter toute contamination. L’ARN était récupéré par ajout d’une solution d’élution. L’ARN purifié était immédiatement stocké à −80°C. Un aliquot d’ARN de 8μl était ensuite utilisé pour l’analyse.


Analyse quantitative et qualitative de l’ARN


La concentration en ARN était calculée avec un spectrophotomètre utilisant une longueur d’onde de 0,2mm (Nanodrop ND 1000, NanoDrop Technologies®, Santa Clara, CA). La qualité des échantillons d’ARN était évaluée par le « 2100 analyzer » (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA). Les échantillons ARN étaient placés sur des puits afin de réaliser une électrophorèse. Le calcul du RNA integrity number (RIN) était réalisé en utilisant le tracé électrophorétique de l’échantillon d’ARN. Le RIN est une évaluation numérique de l’intégrité de l’ARN, autorisant la comparaison entre les échantillons. Nous avons fixé comme seuil un RIN supérieur à 8 pour réaliser l’analyse PCR.


Synthèse d’ADN complémentaire par transcription inverse


Pour chaque échantillon sélectionné, 500ng d’ARN ont permis d’obtenir l’ADN complémentaire (ADNc) simple brin correspondant selon le protocole de high capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Le kit contient des amorces aléatoires, un tampon optimisé de transcription inverse, un mélange équimolaire de deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxythimidine triphosphate (dTTP) et deoxycytidine triphosphate (dCTP), et une enzyme (l’enzyme multiscribe) permettant la transcription inverse. Les échantillons d’ADNc étaient immédiatement stockés à −20°C.


qPCR


La qPCR était réalisée en utilisant un thermocycleur (ABI PRISM 7000). Les réactions de qPCR étaient réalisées en « trois exemplaires » à partir de 5μl d’ADNc issu de la transcription inverse de l’ARN tumoral, dilué au 1/250 dans 96 puits (Applied Biosystems®). Chaque puit contenait 7,5μL de Master Mix SYBR Green (Applied Biosystems®), les amorces sens et antisens (300mM) des gènes Aurora A , Aurora B et β2microglobuline, préalablement définies avec le logiciel Primer Express 3 (Tableau 1). La spécificité des amorces et l’efficacité de la PCR étaient vérifiées pour chaque paire d’amorce avant toute amplification des échantillons tumoraux. Un échantillon était choisi de façon aléatoire comme calibreur interne pour l’amplification d’Aurora A et B. La quantité relative d’ARNm d’Aurora A et B dans les tumeurs était calculée après normalisation du signal de la β2microglobuline selon la formule : 2−ΔΔCt avec ΔCt représentant la différence du cycle seuil entre la cible et les gènes de référence, et ΔΔCt=ΔCt(test)−ΔCt(calibreur).


Analyse statistique


L’expression d’Aurora A et B était définie de façon qualitative comme supérieure ou inférieure à la médiane de l’échantillon. L’association entre le niveau d’expression d’Aurora A et B et les différentes caractéristiques tumorales était calculée selon le test exact de Fischer ou le test de χ2. Nous n’avons pas réalisé d’analyse de survie étant donné le suivi relativement court des patients. Le seuil de significativité était fixé à 0,05. Toutes les valeurs de p correspondent à des tests bilatéraux. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel SPSS (SPSS inc., Chicago, version 13.0).


Résultats


L’âge moyen des 40 patients traités pour CCR était de 65 ans (35–82). L’histologie correspondait à un carcinome à cellules claires pour 24 patients (60 %), à un carcinome papillaire pour 15 patients (37,5 %) et à une tumeur de Bellini pour un patient (2,5 %).

Une valeur seuil du RIN de 8 a été retenue comme seuil limite pour sélectionner les échantillons tumoraux pour l’analyse par RTPCR. Le Tableau 2 présente les caractéristiques clinicopathologiques des 31 patients retenus. Sept patients (22 %) avaient un envahissement ganglionnaire et huit (26 %) des métastases à distance. Soixante-quatorze pour cent des tumeurs étaient de haut grade. Dix-huit patients (58 %) présentaient un carcinome à cellules claires, 12 (39 %) un carcinome papillaire et un (3 %) une tumeur de Bellini. Avec un suivi moyen de 9,3 mois, deux (6,5 %) patients sont décédés de leur cancer et deux (6,5 %) d’une autre cause. Le carcinome de Bellini qui correspond à une entité différente a été exclu de l’analyse RTPCR.

En RTPCR, les expressions moyennes d’Aurora A et B étaient respectivement de 1,02 (0,2–17,5) et 3,01 (0,18–18). La surexpression d’Aurora A était associée à l’envahissement ganglionnaire (p =0,001, Tableau 3) : 86 % des patients avec un envahissement ganglionnaire présentaient une surexpression d’Aurora A contre 35 % des patients sans envahissement ganglionnaire (Figure 2). La surexpression d’Aurora B était associée à la fois à l’envahissement ganglionnaire (p =0,02, Tableau 3) et au sous-type histologique (p =0,001, Tableau 3), l’expression d’Aurora B étant supérieure à la valeur médiane dans 72 % des carcinomes à cellules claires contre 8 % des carcinomes papillaires (Figure 3). Il n’y avait pas de différence significative d’expression d’Aurora A en fonction du type histologique. Nous n’avons pas mis en évidence d’association entre les niveaux d’expression tissulaire d’Aurora A et B et la présence de métastases à distance, le stade tumoral, le grade de Furhman, le score ECOG ou la présence de symptômes (Tableau 3).


Figure 2
Figure 2. 

Expression d’Aurora A en fonction de l’envahissement ganglionnaire.




Figure 3
Figure 3. 

Expression d’Aurora B en fonction du sous-type histologique.





Discussion


Le CCR est en termes de fréquence le troisième cancer urologique et son incidence croît depuis une vingtaine d’années [1]. De nouvelles thérapies, dites ciblées, ont mis en évidence des résultats encourageants. Néanmoins, le gain de survie reste limité et la toxicité de ces traitements est importante [4]. De nouvelles voies thérapeutiques sont donc explorées dans l’espoir de trouver de nouveaux marqueurs prédictifs de l’évolution et/ou de la réponse thérapeutique.

Nous avons mis en évidence une association entre l’expression d’Aurora A et B et l’envahissement ganglionnaire dans le CCR. L’envahissement ganglionnaire est reconnu depuis longtemps comme un facteur pronostique majeur dans les CCR puisqu’il est associé à un taux de survie à cinq ans de 30 % en moyenne [12]. Aurora A et B sont d’importants régulateurs de la mitose [13]. La surexpression de l’ARNm d’Aurora A et B et/ou de leur protéine correspondante a été rapportée dans de nombreux cancers concernant des tissus aussi divers que le pancréas [14], le foie [6], le sein [8], l’ovaire [15] et le côlon [7]. Cependant, les études concernant l’expression des kinases Aurora dans les tumeurs urologiques demeurent peu nombreuses. Il a été noté une corrélation entre l’expression nucléaire d’Aurora B et l’augmentation du score de Gleason dans le cancer de prostate [16]. Sen et al. ont mis en évidence une corrélation entre l’expression d’Aurora A et les cancers de vessie agressifs [17]. Les kinases Aurora apparaissent donc comme des marqueurs de phase I intéressants. Elles semblent être une piste thérapeutique prometteuse et des études sont en cours. En effet, le rôle des kinases Aurora dans le cycle cellulaire en fait une cible rationnelle dans les traitements anticancéreux. Cha et al. ont ainsi récemment démontré que les inhibiteurs des histones désacétylases avaient un effet anticancéreux sur des cellules tumorales rénales par dégradation des kinases Aurora A et B, en bloquant notamment leur association avec l’histone déacétylase 3 [18]. Différents inhibiteurs des kinases Aurora sont en phase de développement précliniques et cliniques, et les résultats des essais cliniques les plus avancés sont encourageants [11]. Notre étude ouvre ainsi des perspectives concernant l’utilisation de ces inhibiteurs dans le traitement du CCR localement avancé.

Nous avons observé que l’expression d’Aurora B était plus importante dans les carcinomes à cellules claires que dans les carcinomes papillaires. Les tumeurs papillaires sont généralement considérées comme des tumeurs de meilleur pronostic que les carcinomes à cellules claires [19]. Cependant, une étude de grande échelle a mis en évidence que le stade TNM et le grade de Fuhrman étaient de meilleurs facteurs pronostiques que le sous-type histologique [20]. La différence d’expression d’Aurora B entre les différents types tumoraux suggère une association avec la tumorigenèse.

Nos résultats doivent être nuancés par un certain nombre de limites. Tout d’abord, il s’agit d’une étude rétrospective. Ensuite, la RTPCR, même si elle est plus précise que l’étude immuno-histochimique, est limitée par des discordances inhérentes au choix des amorces, la variabilité dans l’interprétation et les critères décisionnels, et l’inhomogénéité dans la gestion des échantillons et des procédures techniques. Par ailleurs, le nombre de nos échantillons et le suivi relativement court pourraient avoir limité notre capacité à détecter des différences attribuables à d’autres variables. Dans une étude récente, Kurahashi et al. n’ont trouvé aucune différence entre le niveau d’expression tissulaire d’Aurora A (mesuré par RTPCR et immuno-histochimie) et les facteurs pathologiques et pronostiques reconnus chez les patients présentant un CCR [21]. De plus, la ligature première de l’artère rénale lors de la néphrectomie pourrait avoir altéré l’expression de différentes molécules. En effet, le tissu rénal ayant une activité métabolique intense, l’ischémie peut aboutir à des dommages cellulaires et à une possible altération de l’ARN. Pour cette raison, nous n’avons analysé que des échantillons tumoraux présentant un ARN de qualité. Enfin, il s’agit d’une étude phase I dont les résultats doivent être validés et confirmés par une étude à plus grande échelle.


Conclusions


Les kinases Aurora A et B étaient significativement surexprimées dans les CCR présentant un envahissement ganglionnaire et pourraient avoir une valeur pronostique. Ces résultats doivent être confirmés à l’échelon protéique par immuno-histochimie et hybridation par fluorescence.


Conflit d’intérêt


Aucun.



 Niveau de preuve : 5.





Tableau 1 - Séquences des amorces des gènes Aurora A , Aurora B et β2-microglobuline.
  Séquence  Taille de l’amplicon (PB) 
Aurora A     
Sens  5’ CTG CAT TTC AGG ACC TGT TAA GG 3’  150 
Antisens  5’ AAC GCG CTG GGA AGA ATT T 3’   
 
Aurora B     
Sens  5’ GCG AGT CCT CCG GAA AGA 3’   
Antisens  5’ CGT TAA GAT GTC GGG TGT CC 3’  130 
 
β2-microglobuline     
Sens  5’ TGA CTT TGT CAC AGC CCA AGA TA 3’   
Antisens  5’ CGG CAT CTT CAA ACC TCC A 3’  75 





Tableau 2 - Caractéristiques cliniques et pathologiques des 31 patients retenus pour l’analyse PCR après calcul du RNA integrity number (RIN).
Nombre de patients  31 
Âge (min–max)  65 ans (35–82) 
Stade T   
T1-T2  14 (45 %) 
T3-T4  17 (55 %) 
 
Envahissement ganglionnaire  7 (22 %) 
Métastases à distance  8 (26 %) 
Grade   
1–2  8 (26 %) 
3–4  23 (74 %) 
 
Sous-type histologique   
Cellule claire  18 (58 %) 
Papillaire  12 (39 %) 
Bellini  1 (3 %) 
 
Suivi moyen (min–max)  9,3 mois (0–27) 



Légende :
Min : minimum ; max : maximum.



Tableau 3 - Association entre des niveaux d’expression d’Aurora A et B, et critères pronostiques de carcinome à cellules rénales (la tumeur de Bellini a été exclue de l’étude).
Variables  valeur p (Aurora A)  valeur p (Aurora B) 
Envahissement ganglionnaire  0,001  0,02 
Métastases à distance  0,4  0,8 
Stade  0,3  0,2 
Grade  0,4  0,6 
ECOG  0,3  0,7 
Présence de symptômes  0,14  0,2 
Sous-type histologique  0,2  0,001 



Légende :
ECOG : Eastern Cooperative Oncology Group Study performance score .


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