Effet des extraits de plantes médicinales sur la dissolution des calculs rénaux de cystine in vitro : étude à l'échelle mésoscopique

25 septembre 2012

Auteurs : B. Hannache, D. Bazin, A. Boutefnouchet, M. Daudon
Référence : Prog Urol, 2012, 10, 22, 577-582




 



La lithiase urinaire affecte 6 à 15 % de la population dans les pays industrialisés, selon la région géographique. Pour la traiter ou la prévenir, de nombreuses populations à travers le monde ont recours aux plantes médicinales, ce qui constitue une pratique très ancienne [1, 010]. La médecine traditionnelle, principalement basée sur les plantes, est mise en œuvre par presque 80 % de la population mondiale [3] qui utilise des plantes ou leurs extraits contre de très nombreuses pathologies [4, 5, 6] y compris contre les calculs [1].


Les données épidémiologiques montrent que plus de 80 % des calculs sont composés principalement d’oxalate de calcium (CaOx) et associés dans la plupart des cas à des désordres nutritionnels [7]. De ce fait, l’utilisation des extraits de plantes, essentiellement dirigées contre cette lithiase oxalocalcique, a fait l’objet de diverses publications [8, 9, 10]. En revanche, très peu de travaux se sont intéressés à des lithiases plus rares, posant souvent plus de problèmes de prise en charge, telles que la lithiase cystinique [11].


Dans ce travail, nous avons choisi d’étudier l’effet d’extraits de plantes sur les calculs rénaux de cystine. Ces calculs, qui résultent d’une tubulopathie héréditaire, la cystinurie lysinurie [12], sont particulièrement récidivants et nécessitent de multiples interventions urologiques. Différents traitements sont utilisés pour lutter contre la formation de ces calculs [12, 13] : cure de diurèse, alcalinisation des urines, médicaments porteurs d’un groupe thiol capables de former des complexes avec la cystine [14, 15]. Cependant, un tel traitement médical est souvent mal toléré avec un taux élevé d’effets secondaires. En ce qui concerne les plantes médicinales proposées contre les calculs de cystine, une seule étude, publiée récemment dans cette revue, a montré in vitro que les extraits de Zea mays, Ammi visnaga, Herniaria hirsuta et Opuntia ficus-indica étaient capables de dissoudre les calculs de cystine en quelques semaines [11].


Le but de cette étude a été d’évaluer les effets solvants d’autres plantes incluant Arenaria ammophila (tiges et feuilles), les feuilles de Parietaria officinalis , les fleurs de P. officinalis , et les fleurs de Paronychia Argentea déjà utilisées en médecine traditionnelle contre la lithiase rénale. Pour ce faire, nous avons suivi ex vivo la variation de masse des calculs et les modifications structurales éventuelles à l’échelle mésoscopique par observation des calculs à l’aide d’un microscope électronique à balayage (MEB) au cours de la même période d’incubation que celle utilisée dans l’étude précédente, soit huit semaines [11]. Nous avons complété ces observations par des mesures du pH de la solution afin de discuter l’effet de ce paramètre sur une dissolution éventuelle.


Matériel et méthode


Quinze calculs rénaux de cystine pure provenant de la clinique rénale de Daksi-Constantine (Algérie) ont été sélectionnés par examen en microscopie binoculaire et après analyse par spectrophotométrie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Leur taille était de 7±1mm et leur masse de 472±52mg. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre FTIR Bruker IFS25 (Bruker Spectrospin, Wissembourg, France) entre 4000 et 400cm−1 avec une résolution de 4cm−1 comme décrit précédemment [16].


Un extrait de chaque plante a été préparé par infusion, pendant 30minutes, de 3 g de plante sèche dans 100mL de solution physiologique bouillante (9 g de NaCl par litre), la solution de NaCl de 9 g/L étant utilisée par ailleurs comme milieu témoin pour apprécier les modifications de masse et/ou de structure des calculs. Après filtration, l’extrait a été réparti (60mL) dans des erlenmeyers en verre (Figure 1a). Le calcul a été placé dans un sachet poreux en fibres tressées afin d’éviter tout contact avec le barreau magnétique et mis en suspension dans l’extrait. Ainsi, les calculs rénaux ont été isolés de tout effet mécanique. Chaque extrait a été mis sous une agitation magnétique constante de 130 t/min. Pour chaque expérience, le pH de la solution a été mesuré tous les 15jours à l’aide d’un pH-mètre et la perte de masse des calculs rénaux évaluée par pesée du calcul après séchage dans une étuve à 40°C pendant 18heures. Chaque expérience a été réalisée en triple.


Figure 1
Figure 1. 

a : fiole contenant le calcul inséré dans un sachet immergé ; b : évolution de la masse des calculs de cystine (cercles bleus pour Arenaria (fleurs et tiges), triangles verts pour Paronychia (flowers ), carrés rouges pour Parietaria (feuilles), triangles noirs pour Parietaria (fleurs), cercles blancs pour la solution aqueuse de NaCl 9g/L ; c : perte de masse des calculs de cystine (légendes identiques à celles de la Figure 1b) ; d : évolution du pH durant l’expérience (légendes identiques à celles de la Figure 1b).




Un MEB à effet de champ Zeiss SUPRA55-VP a été utilisé pour les observations de microstructure. Pour préserver l’intégrité des échantillons, les mesures ont été effectuées à un voltage bas (1,2 KV) et sans aucun dépôt de carbone préalable sur la surface de l’échantillon.


Le traitement statistique des données a été effectué avec le logiciel NCSS (NCSS statistical package, J. Hintz, Gainesville, FL).


Résultats


La perte moyenne de masse des calculs pour l’ensemble des expériences a été de 64±39mg au bout de huit semaines. Les changements de masse des calculs de cystine pendant l’incubation avec chaque extrait ou la solution témoin sont présentés sur la Figure 1b. Les cinétiques de dissolution semblent être différentes selon l’extrait de plante. Durant les deux premières semaines, la masse des calculs a peu varié. Entre deux et quatre semaines, le taux de dissolution est resté faible et a commencé à augmenter entre quatre et six semaines, en particulier pour Arenaria ammophila et les fleurs de P. officinalis . Les résultats se sont confirmés après huit semaines, ces deux extraits de plantes montrant un effet sur la dissolution des calculs plus marqué que les autres, exprimé par une perte de masse importante par rapport aux autres extraits et surtout à la solution de NaCl. Toutefois, cette perte de masse (19,1 % vs 8,7 % pour la solution témoin) n’a pas atteint le seuil de significativité (p =0,051) sur la période de huit semaines fixée pour l’expérience.


Sur la Figure 1c, est rapportée la perte moyenne de masse des calculs selon l’extrait. On peut constater que la perte de masse était de 99mg à la fin de l’expérience (huit semaines) pour l’extrait d’Arenaria (p =0,051) et de 80mg pour les fleurs de P. officinalis (p =0,11) versus 44mg pour la solution de NaCl.


En ce qui concerne le pH du milieu (Figure 1d), la valeur initiale variait de 5,8 pour P. argentea à 8,8 pour les feuilles de P. officinalis (p <0,001). Nous avons observé une diminution initiale du pH pendant les quatre premières semaines de l’expérience pour tous les extraits de plantes ainsi que pour la solution témoin.


Les Figure 2a et b montrent les images MEB des cristallites de cystine respectivement avant et au stade final dans le cas de la solution aqueuse de NaCl 9g/L comparées à celles des calculs de cystine en contact avec l’extrait d’Arenaria (Figure 2c). Bien que des différences semblent exister à l’échelle mésoscopique entre les surfaces des calculs soumis à l’action des extraits de plantes par rapport à celle observée avant traitement, il est difficile de les quantifier. Le traitement paraît avoir dissout en partie les petits cristaux de cystine, ne laissant bien visibles que les plus gros d’entre eux, séparés par des espaces vides plus ou moins larges. L’extrait de P. officinalis (Figure 2e) exerçait un effet similaire à celui d’Arenaria , l’organisation des cristaux apparaissant feuilletée en raison, d’une orientation différente (Figure 2c). En revanche, l’extrait de Paronichia argentea semble avoir eu peu d’effets sur la structure des calculs (Figure 2d).


Figure 2
Figure 2. 

Surface des cristaux visualisés par MEB : a : avant tout traitement ; b : après traitement par la solution aqueuse de NaCl 9g/L ; c : après traitement par la solution contenant Arenaria ammophila  ; d : après traitement par la solution contenant Paronychia argentea  ; e : après traitement par la solution contenant Parietaria officinalis (fleurs) ; f : après traitement par la solution contenant P. officinalis (feuilles).





Discussion


Les plantes sélectionnées pour notre étude n’ont pas été choisies aléatoirement. Elles sont utilisées actuellement en Algérie pour le traitement médical des calculs rénaux ou pour prévenir leur formation. Bien qu’en Algérie comme dans tous les autres pays, l’oxalate de calcium soit la forme cristalline la plus courante, nous avons choisi les calculs de cystine parce que ce type de calcul est souvent plus difficile à traiter et à prévenir par les procédures urologiques et médicales actuellement disponibles. De plus, il a été montré récemment que des plantes utilisées en médecine traditionnelle au Maroc contre les calculs en général étaient capables de dissoudre efficacement in vitro les calculs de cystine [11].


Nous avons donc étudié in vitro l’effet de quatre extraits de plantes sur la dissolution de calculs rénaux de cystine bien caractéristiques et nous avons choisi le MEB à effet de champ pour suivre les changements éventuels dans la morphologie des cristallites permettant d’affirmer l’existence d’interactions entre les extraits de plantes et les calculs. De nombreuses études basées sur les observations MEB des calculs rénaux [17, 18] ont largement démontré que cette technique était bien adaptée à cette problématique. Avec un microscope moderne comme le FEI-Zeiss, il est possible d’observer les détails de la surface des cristallites sans avoir à recouvrir l’échantillon avec une couche conductible de carbone, ce qui permet de répéter les observations au cours de l’expérience sans modifier la surface des prélèvements par un traitement qui pourrait gêner l’action ultérieure des extraits de plante testés.


Nos résultats n’ont pas permis de voir une différence significative entre les extraits ni entre les extraits et la solution témoin en ce qui concerne la perte de masse des calculs de cystine sur la période expérimentale choisie. Cependant, l’examen de la Figure 1c montre que la pente de la courbe de dissolution obtenue pour l’extrait d’A. ammophila s’accentuait fortement dans les dernières semaines par rapport aux courbes observées avec les autres extraits, suggérant que cette plante est probablement plus efficace que les autres pour dissoudre les calculs de cystine, mais demande sans doute plus de temps que les plantes testées dans l’étude marocaine précédemment publiée. À l’échelle mésoscopique, des changements à la surface des calculs rénaux ont été observés dés le premier examen, c’est-à-dire au bout de deux semaines d’expérimentation (données non montrées), mais ne sont devenus perceptibles, en termes de perte de masse cristalline, qu’après quatre à six semaines de contact avec les extraits ou la solution de contrôle.


Notre protocole expérimental était un peu différent de celui décrit pour l’étude des plantes marocaines en ce sens que les calculs ont été enfermés dans un sachet poreux en fibres tressées pour éviter le contact avec le barreau magnétique. Ce protocole a été choisi pour éviter une dissociation des cristaux de cystine à la surface des calculs par un effet mécanique et non par le seul effet chimique de la solution testée. Cette différence pourrait être à l’origine de l’efficacité retardée des extraits de plantes testés. Pour le vérifier, une nouvelle expérience sera réalisée, comparant les effets des plantes testées dans l’étude marocaine, en particulier Zea mays et Ammi visnaga , et de celles examinées dans le présent travail, notamment A. ammophila et les fleurs de P. officinalis .


En ce qui concerne le pH du milieu, la valeur initiale apparaît très différente selon les extraits, comprise entre 5,8 pour P. argentea et 8,8 pour les feuilles de P. officinalis (p <0,001). La valeur élevée du pH suggère un effet d’alcalinisation sur la dissolution des calculs de cystine pour certains extraits. Cependant, si on compare la courbe de pH obtenue avec la solution saline à celle obtenue avec les extraits d’A. ammophila ou des fleurs de P. officinalis , on constate que les courbes sont très voisines, suggérant que les effets des extraits de plante sur la perte de masse des calculs ne sont pas liés au pH mais à la composition chimique de l’extrait de plante.


Conclusion


L’effet de plusieurs plantes médicinales utilisées dans le traitement des calculs en médecine traditionnelle a été étudié in vitro à l’échelle mésoscopique par microscopie électronique à balayage. Les changements dans les caractéristiques ultrastructurales des calculs rénaux de cystine après traitement avec les plantes médicinales suggèrent que ces plantes exercent un effet sur les cristaux de cystine, mais l’évaluation des résultats par la perte de masse des calculs comparativement à une solution de référence de NaCl 9g/L n’a pas permis de mettre en évidence un effet solvant significatif de ces extraits de plante sur la période expérimentale choisie. Au vu des courbes de perte de masse des calculs testés, ce manque de significativité s’explique probablement par une durée de contact insuffisante. De ce fait, malgré leur utilisation en médecine traditionnelle pour le traitement de la lithiase, on ne peut recommander, dans l’état actuel de nos connaissances, l’utilisation de ces plantes pour le traitement ou la prévention des calculs de cystine. Des essais complémentaires seront nécessaires pour objectiver un bénéfice scientifiquement démontré de certains des extraits testés sur la solubilisation de tels calculs. Compte tenu des délais nécessaires pour observer un effet bénéfique in vitro, il paraît difficile de recommander ces plantes chez les patients cystinuriques pour dissoudre des calculs de cystine in situ. Cependant, ces plantes pourraient avoir un intérêt, qui reste à évaluer, pour la prévention des récidives.


Déclaration d’intérêts


Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.



 Niveau de preuve : 5.




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