Comparaison in vivo de la préservation d'ïlots de Langerhans murins

25 avril 2006

Mots clés : Transplantation, liquide de préservation, polyéthylèneglycol, rein.
Auteurs : NEUZILLET Y., GIRAUD S., LAGORCE L., EUGENE M., RICHARD F., DEBRE P., BARROU B
Référence : Prog Urol, 2006, 16, 73-77
But de l'étude: Un nouveau liquide de conservation contenant du PolyEthylèneGlycol (PEG) a été étudié par notre équipe. La longueur de chaïne du PEG détermine ses propriétés biologiques. Le but de notre étude a été de définir la longueur de chaïne optimale de PEG pour obtenir la meilleure préservation. Matériel et Méthode: Un modèle murin de transplantation d'ïlots de Langerhans a été utilisé. Des solutions contenant des PEG de 8 kDa, 20 kDa ou 35 kDa à la concentration molaire de 1,5 mM/L ont été comparées à l'HBSS. Les taux de non fonction primaire (NFP) et la survie moyenne des greffons dans ces 4 groupes ont été étudiés.
Résultats : Nous avons obtenu une meilleure préservation avec le PEG 20 kDa qu'avec les 8 kDa ou 35 kDa (taux de NFP de respectivement 0% vs 56% vs 37%). La différence avec l'HBSS (22% de NFP) a été non significative. De plus la survie a été prolongée avec le PEG 20 kDa par rapport au PEG 35 kDa (23,1 ± 4,4 jours vs 8,6 ± 7,6 jours). Les différences avec l'HBSS (13,4 ± 11,8 jours) et le PEG 8 kDa (12,2 ± 14,7 jours) n'ont pas été significatives.
Conclusion : La meilleure préservation a été obtenue avec le PEG 20 kDa à la concentration molaire de 1,5 mM/L. D'autres concentrations de PEG doivent être étudiées.



La destruction des cellules b des ïlots de Langerhans entraïne une dérégulation de la glycémie par carence en insuline. Une hyperglycémie plasmatique à jeun > 1,26 g/l (soit 7 mmol/l) définit le diabète. La greffe de pancréas entier ou d'ïlot de Langerhans permet de réintroduire une production endogène d'insuline répondant aux stimuli physiologiques chez le receveur. Cependant, la morbidité de la chirurgie et la nécessité d'une immunosuppression sont en défaveur de ce type de traitement. Il est donc indiqué lorsqu'une autre transplantation est nécessaire (par exemple une transplantation rénale) [17]. La greffe d'ïlots de Langerhans présente les avantages d'éviter la transplantation du tissu exocrine pancréatique et d'être une greffe cellulaire beaucoup plus accessible qu'un greffon vascularisé à des manipulations immunologiques.

La conservation des organes et tissus en vue de greffe ou de transplantation fait appel à des solutions particulières. La solution de l'Université du Wisconsin (UW) est actuellement la plus utilisée en transplantation d'organe. Il s'agit d'une solution de type intra-cellulaire (125 mmol/l de K+, 30 mmol/l de Na+) contenant un colloide, l'hydroxyethyl starch, limitant les effets osmotiques sur les cellules. Ces concentrations ioniques déterminées initialement pour limiter les échanges osmotiques à travers la membrane stimulent en réalité les pompes Na+/K+ ATPase situées dans la membrane des cellules et épuisent les réserves en ATP des cellules [4]. Par ailleurs la forte concentration en potassium dans l'espace vasculaire entraine une dépolarisation des cellules musculaires lisses [10, 11, 18] des vaisseaux et donc une vasoconstriction [6]. Cette augmentation des résistances vasculaires est également délétère pour l'organe transplanté. Les solutions de type extra-cellulaire sont pour ces raisons préférables.

Notre équipe travaille sur une nouvelle solution de type extra-cellulaire (5 mmol/l de K+, 118 mmol/l de Na+), appelée "Solution de Conservation des Organes et Tissus" (S.C.O.T.) et contenant un colloide, le Polyéthylèneglycol (PEG). Les PEG sont des longues chaïnes hydrocarbonées OH(CH2-CH2-O)nH, introduites expérimentalement et chez l'homme dans les solutions de conservation d'organes et de tissus pour leur effet de diminution de l'oedème tissulaire, de protection contre les radicaux libres, et de diminution de l'immunogénicité du greffon [7]. Ils sont considérés comme atoxiques, contrairement à l'HES contenu dans la solution UW, responsable d'une toxicité tubulaire rénale et d'un effet aggrégant sur les hématies [16]. Ils sont couramment utilisés en pharmacologie pour augmenter la durée de vie des médicaments.

Le PEG a une forte solubilité dans l'eau à des températures modérées quelque soit son poids moléculaire. Cela résulte d'un effet de structure des molécules d'eau le long de la molécule de PEG dont la forme hélicoidale de sa chaïne augmente les liaisons hydrogènes et minimise les groupes hydrophobes. Les molécules d'eau forment ainsi 2 à 10 couches structurées autours de la molécule de PEG [8]. Le PEG est ainsi responsable d'une diminution de l'immunogénicité du greffon par un phénomène d'immunocamouflage. En effet, le PEG absorbé à la membrane des cellules est entouré de couches structurées d'eau qui masquent les sites antigéniques des cellules [8].

La longueur de la chaïne hydrocarbonée OH(CH2-CH2-O)nH,du PEG détermine l'encombrement spatial de la molécule, responsable de son rôle protecteur et immunomasquant [5]. La longueur des chaïnes de PEG a déterminé leur capacité à masquer des molécules de surface, les PEG 20 kDa ayant masqué des molécules plus grandes que les PEG 5 kDa [5]. La hauteur de la synapse immunologique a été évaluée à 15 nm au niveau de la zone d'interaction CMH+peptide/TCR [8]. Le PEG 20 kDa lorsqu'il est fixé sur la membrane cellulaire, occupe une hauteur d'environ 20 nm [8]. Cette taille de molécule nous a donc semblé idéale pour interférer avec la synapse immunologique.

Néanmoins il n'existe aucune possibilité matérielle simple de vérifier cette hypothèse.

Ceci nous conduit à tester d'autres longueurs de chaïnes de PEG, plus courtes ou plus longues, dans une solution par ailleurs identique à S.C.O.T.. Trois longueurs de chaïnes ont été retenues et seront testées :

- PEG 8 kDa

- PEG 20 kDa

- PEG 35 kDa

Le but de notre travail sera de caractériser in vivo la préservation des ïlots de Langerhans par trois solutions différentes par la longueur des chaïnes de PEG qu'elles contiennent. Nous comparerons, en fonction de la longueur de chaïne du PEG, les taux de non fonction primaire (NFP) (principalement due à la souffrance cellulaire liée à l'ischémie) et la survie des greffons dans le modèle murin d'allogreffe d'ïlots pancréatiques habituellement utilisé par notre équipe.

Matériel et méthodes

Liquides de conservation

Dans la solution S.C.O.T., le PEG 20 kDa est utilisé à une concentration de 30 g/L. Ceci correspond à une concentration molaire de 1,5 mM/L. Afin de n'avoir que la longueur de chaïne du PEG comme variable, nous utiliserons le PEG à des concentrations isomolaires à celle de S.C.O.T. :

- PEG 8 kDa à la concentration de 12 g/L

- PEG 20 kDa à la concentration de 30 g/L (concentration de référence)

- PEG 35 kDa à la concentration de 52,5 g/L

La solution S.C.O.T. a été utilisée pour étudier l'effet du PEG 20 kDa à la concentration de 30 g/L (concentration de référence). Les deux autres solutions ont été obtenues à partir d'une solution S.C.O.T. (Macopharma, Tourcoing, France) dépourvue de PEG. Les PEG à étudier (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) ont été dissous dans la solution S.C.O.T. sans PEG par agitation 10 minutes à température ambiante.

Modèles d'études

Afin de caractériser, in vivo, la préservation des ïlots de Langerhans par les différentes solutions, une étude comparative est réalisée dans un contexte d'allogreffes entre les 4 groupes suivants :

- Groupe n°1 : HBSS (témoin), 9 souris.

- Groupe n°2 : PEG 8 kDa à la concentration de 12 g/L, 9 souris.

- Groupe n°3 : PEG 20 kDa à la concentration de 30 g/L (Solution S.C.O.T.), 8 souris.

- Groupe n°4 : PEG 35 kDa à la concentration de 52,5 g/L, 8 souris.

La figure 1 illustre le modèle d'allogreffe d'ïlots de Langerhans sous la capsule rénale chez la souris. Les souris donneuses sont des mâles de fond génétique C3H âgées de 6 à 8 semaines. Elles sont d'haplotype H-2Kk. Les receveurs sont des mâles Balb/C d'haplotype H-2Kd, âgés de 6 à 8 semaines.

Figure 1 : Modèle de transplantation d'îlots de Langerhans sous la capsule rénale chez la souris. (1) : Les souris receveuses sont rendues diabétiques par une méthode chimique d'injection intra-péritonéale de Streptozotocine. (2) : Obtention du greffon par prélèvement du pancréas, digestion statique du pancréas, purification des îlots par gradient de Ficoll puis transplantation des îlots sous la capsule rénale. (3) : néphrectomie réalisée dans le but de savoir si le greffon est fonctionnel puisqu'il se situe sous la capsule rénale, si l'animal a régénéré ses cellules b ou si la streptozotocine n'a eu qu'une action transitoire.

Les protocoles d'obtention du greffon, de transplantation des ïlots pancréatiques sous la capsule rénale et de suivi glycémique ont été précédemment rapportés par notre équipe [3]. Brièvement, le prancréas prélevé après distension par la Libérase à 0,3 mg/mL, subit une digestion statique à 37°C pendant 12 minutes. Les ïlots sont purifiés par gradient discontinu d'EuroFicoll à 4 couches, puis par hand-picking. Ils sont ensuite mis en culture dans 7 mL de milieu de culture RPMI complet (SVF 10% + ATB 1% + Hepes 1% + Glutamine 1% + Acides aminés non essentiels 1%) (Sigma, St Quentin Fallavier, France / Gibco BRL, Cergy Pontoise, France) pour un isolement d'ïlots de Langerhans en HBSS (groupe n°1) ou de RPMI complet contenant :

- du PEG 8 kDa à la concentration de 12 g/L (groupe n°2).

- du PEG 20 kDa à la concentration de 30 g/L (groupe n°3).

- du PEG 35 kDa à la concentration de 52,5 g/L (groupe n°4).

Après numération, les ïlots sont greffés sous la capsule rénale des souris receveuses. Celles-ci ont été préalablement rendues diabétiques par une injection intra-péritonéale de Streptozotocine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). La survie du greffon est ensuite déterminée par mesure glycémique. Le rejet est défini par deux mesures glycémiques successives supérieures à 200 mg/dL.

Méthodologie statistique

L'analyse statistique des variables continues a été faite par le test t de Student. Les courbes de survie ont été calculées selon la méthode de Kaplan Meier et comparées par le test de Logrank. La différence observée a été considérée comme significative pour p < 0,05.

Résultats

Taux de NFP

Les différents taux de NFP observés dans chaque groupe sont rapportés dans le tableau I. Le taux de NFP a été significativement plus faible dans le groupe n°3 que dans les groupes n°2 (p < 0,01) et n°4 (p < 0,05). Le taux de NFP a été significativement plus élevé dans le groupe n°2 que dans le groupe n°1 (HBSS, p < 0,05).

Tableau I : taux de NFP observés en fonction de la solution de conservation utilisée.

Survie des greffons

Les durées moyennes de survies observées dans chaque groupe sont rapportées dans le tableau II. La durée moyenne de survie des greffons du groupe n°3 a été significativement plus longue que celle du groupe n°4 (p < 0,001). L'utilisation de la solution contenant 30 g/L de PEG 20 kDa a permis une survie plus prolongée que la solution contenant 52g/L de PEG 35 kDa.

Tableau II : Durées moyennes de survie observées en fonction de la solution de conservation utilisée.

Les courbes de survie calculées pour chaque groupe sont présentées dans la figure 2. La courbe de survie des greffons du groupe n°4 est significativement inférieure à celle du groupe n°3 (p < 0,0001) et n°1 (p < 0,05). L'utilisation de la solution contenant 52g/L de PEG 35 kDa a été associée à une survie plus courte que l'utilisation de la solution contenant 30 g/L de PEG 20 kDa ou de l'HBSS.

Figure 2 : Courbe de survie des greffons observées en fonction de la solution de conservation utilisée : (Log Rank groupe n°4 vs groupe n°3 : p < 0,0001)

Les courbes de survie calculées pour chaque groupe en censurant les pertes de greffon à J0 lié à la survenue d'une NFP sont présentées dans la figure 3. La courbe de survie des greffons du groupe n°4 est significativement inférieure à celle du groupe n°2 et 3 (p < 0,001). Lorsque les greffons n'ont pas fait de NFP, l'utilisation de la solution contenant 52g/L de PEG 35 kDa a été associée à une survie plus courte que l'utilisation de la solution contenant 30 g/L de PEG 20 kDa ou 12 g/L de PEG 8 kDa.

Figure 3 : Courbe de survie des greffons observées en fonction de la solution de conservation utilisée en censurant les pertes de greffons par survenue d'une non fonction primaire : (Log Rank groupe n°4 vs groupe n°3 : p < 0,001)

Discussion

L'utilisation de la solution contenant 30 g/L de PEG 20 kDa (groupe n°3) a permis d'améliorer la fonctionnalité des ïlots pancréatiques transplantés par rapport aux solutions contenant 12 g/L de PEG 8 kDa (groupe n°2) ou 52,5 g/L de PEG 35 kDa (groupe n°4). La concentration molaire en PEG ayant été égale dans chacune de ces solutions, seule la longueur de la chaïne hydrocarbonées OH(CH2-CH2-O)nH,du PEG a différé entre les solutions utilisées dans les groupes n°2, 3 et 4. Des trois longueurs de chaïnes de PEG étudiées, celle de 20 kDa a permis d'obtenir les meilleurs résultats en terme de préservation et de survie des greffons. La capacité du PEG 20 kDa à améliorer la préservation des organes et tissus avait déjà été rapportée par d'autres auteurs dans des modèles différents. Dans un modèle de reins de rats isolés et perfusés, Hauet a montré que les 30 g/L de PEG 20 kDa présents dans une solution de type intra-cellulaire permettaient de diminuer la déplétion en ATP des cellules [13]. Dans un modèle d'auto-transplantation de rein de porc la même équipe a montré que l'adjonction de 30 g/L de PEG 20 kDa dans des solutions de type intra- ou extra-cellulaire permettaient d'inhiber la réponse inflammatoire dûe au phénomène d'ischémie-reperfusion [12].

Nos différents travaux antérieurs avaient montré que la différence de survie moyenne des ïlots préservés avec l'HBSS ou la solution S.C.O.T. était de 10 jours. Cette différence, en faveur de la solution S.C.O.T., faisait poser l'hypothèse que la durée de fixation du PEG 20 kDa à la surface des cellules était de 10 jours. Il a été intéressant de constater dans nos résultats que la différence de survie moyenne observée entre les groupes utilisant l'HBSS et le S.C.O.T. était encore de 10 jours.

L'utilisation de PEG 8 kDa a été associée à un taux de NFP plus élevé qu'avec le PEG 20 kDa ou l'HBSS. Les données de la littérature ne laissaient pas attendre ces résultats. MARSH DC et al. ont montré que l'adjonction de PEG 8 kDa à la concentration de 5 g/L à une solution UW est capable d'améliorer la préservation d'hépatocyte par rapport à la solution UW seule [15]. Dans notre étude l'UW n'a pas été utilisée comme témoin. Ceci complique l'interprétation de nos résultats par rapport à ceux de la littérature. Cependant l'HBSS ne contenant pas de colloide, nous attendions un taux plus faible de NFP avec le PEG 8 kDa qu'avec l'HBSS. Notre étude a montré, au contraire, que la solution contenant 12 g/L de PEG 8 kDa donne les moins bons résultats en terme de préservation des ïlots pancréatiques.

Les hypothèses que nous pouvons avancer pour expliquer ce résultat sont : - La concentration de 12 g/L du PEG 8 kDa.

Cette concentration, supérieure au 5 g/L utilisée par Marsh., pourrait être la cause de ce résultat par un mécanisme qui restera à expliquer. Les travaux de Faure sur le PEG 20 kDa ont montré l'importance de la concentration en PEG dans la solution pour l'obtention d'une meilleure préservation de reins de porc autotransplantés [9]. L'amélioration de la préservation a été décrite pour une concentration de 30 g/L mais pas à une concentration supérieure (50 g/L) [9]. Nous assistons peut-être au même phénomène avec le PEG 8 kDa dans notre expérience. - La supériorité de l'HBSS par rapport à l'UW pour la préservation des ïlots.

L'UW ayant une composition de type intra-cellulaire, les pompes Na+/K+ ATPase situées dans la membrane des cellules sont stimulées par la forte concentration extra-cellulaire en ion K+ et épuisent les réserves en ATP des cellules [4]. La composition de type extra-cellulaire de l'HBSS pourrait donc expliquer ces meilleurs résultats.

La durée moyenne de survie des ïlots dans le groupe n°2, utilisant le PEG 8 kDa, n'a pas été significativement différente de celle des autres groupes. Cependant elle a semblé inférieure à celle observée avec le PEG 20 kDa (12,2 ± 14,7 vs 23,1 ± 4,4, différence non statistiquement significative). Dans un modèle d'allogreffe d'intestin chez le rat, ITASAKA H. et al. ont montré une survie plus longue avec le PEG 20 kDa qu'avec le PEG 8 kDa [14]. Cette différence a été expliquée par les propriétés d'immunomasquage spécifique à la molécule de PEG 20 kDa.

Résultats du PEG 35 kDa

L'utilisation de la solution contenant 52,5 g/L de PEG 35 kDa a été associée à une survie moyenne moins longue et à une courbe de survie significativement inférieure à celles obtenues avec la solution S.C.O.T.

Lorsque l'on étudie les courbes de survie en censurant les pertes de greffons par survenue à J0 d'une NFP, la courbe obtenue avec la solution contenant 52,5 g/L de PEG 35 kDa a été significativement inférieure. Ceci suggère qu'il n'y a pas eu de phénomène d'immunomasquage (survie comparable à celle obtenue avec l'HBSS qui n'est pas immunomasquant) ou que le PEG 35 kDa a été toxique pour les ïlots à cette concentration.

Il n'y a pas, à notre connaissance, d'autre étude portant sur la préservation d'organe ou de tissus avec une solution contenant du PEG 35 kDa à la concentration de 52,5 g/L (c'est-à-dire equimolaire à celle de S.C.O.T.) mais à une concentration fort différente (1 g/L) interdisant toute comparaison directe, ce d'autant que les modèles utilisés sont différents [1, 2].

Conclusion

L'objectif de notre travail était de connaïtre la longueur optimale de la chaïne de PEG à adjoindre à la solution de type extra-cellulaire que nous étudions. Nos résultats permettent d'affirmer qu'à la concentration molaire de 1,5 mM/L le PEG 20 kDa donne de meilleurs résultats en terme de taux de NFP et de survie du greffon que les PEG 8 kDa et 35 kDa. La diminution du taux de NFP témoigne d'une diminution des lésions induites par l'ischémie par le PEG 20 kDa. La prolongation de la survie témoigne d'un phénomène d'immunomasquage par le PEG 20 kDa. Ce phénomène n'a pas été retrouvé avec le PEG 8 kDa (12 g/L) ou le PEG 35 kDa (52,5 g/L). Les concentrations en PEG des solutions utilisées pourraient expliquer ces résultats. L'étape suivante de notre travail sera de déterminer la concentration molaire optimale en PEG en testant les concentrations utilisées dans les différentes solutions de conservation contenant du PEG.

Références

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