Comparaison des taux d'estradiol et de testostérone dans le sang périphérique et dans le sang spermatique chez les patients avec azoospermie sécrétoire

25 novembre 2008

Auteurs : G. Pasquier, N. Rives, A. Bouzouita, R. Caremel, L. Sibert
Référence : Prog Urol, 2008, 10, 18, 663-668




 




Introduction


La stérilité affecte environ 15 % des couples et, dans un peu plus d’un tiers des cas, c’est l’homme seul qui est en cause, soit environ un homme sur 25 [1]. L’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) recueillis dans l’épididyme et dans le testicule a profondément modifié les possibilités de prise en charge des patients azoospermiques. Le prélèvement chirurgical testiculaire de spermatozoïdes a tout d’abord été réalisé dans les cas d’azoospermie obstructive avec spermatogenèse normale, notamment en cas d’échec du prélèvement épididymaire (absence complète, canal épididymaire fibrosé). Puis, l’extraction de spermatozoïdes testiculaires a été proposée dans les azoospermies non obstructives associées à des altérations sévères de la spermatogenèse [2]. Dans cette deuxième indication, des spermatozoïdes utilisables en ICSI sont isolés dans 30 à 60 % des cas [3]. De plus, les données de la littérature ont confirmé l’absence de différence de résultats en ICSI entre sperme éjaculé, sperme épididymaire et sperme testiculaire, frais ou cryoconservé [4]. L’extraction de sperme testiculaire par prélèvement chirurgical associée à l’ICSI offre donc aux patients azoospermiques une chance d’assurer leur descendance avec leurs propres gamètes.

Bien que le prélèvement chirurgical de spermatozoïdes soit devenu une option thérapeutique validée en cas d’azoospermie non obstructive, l’échec de l’extraction reste cependant fréquent [2]. Compte tenu des contraintes techniques (biopsie testiculaire, protocole d’induction de l’ovulation et ponction ovocytaire), psychologiques et financières imposées aux couples, il semble capital de pouvoir déterminer les facteurs prédictifs de la présence de spermatozoïdes testiculaires, ainsi que leur qualité nucléaire et leur pouvoir fécondant. Lors du bilan clinique initial d’une azoospermie, le dosage sérique de la FSH et l’évaluation du volume testiculaire permettent d’orienter vers une origine obstructive ou non obstructive. La valeur prédictive du dosage de la FSH quant à la présence de spermatozoïdes testiculaires lors de l’extraction reste faible [5].

Par ailleurs, un rôle majeur est joué par les hormones testiculaires dans le développement et le maintien de la spermatogenèse. La testostérone a un rôle de messager paracrine qui module l’activité des cellules contenues dans le tube séminifère : cellules de Sertoli et cellules germinales [6]. De nombreux travaux expérimentaux ont prouvé l’intervention des estrogènes au sein d’interactions modulatrices entre cellules de Leydig et tubes séminifères dont l’objectif final est d’optimiser la stéroïdogénèse et de créer en retour un microenvironnement adéquat pour un déroulement de la spermatogenèse dans les meilleures conditions [7]. La testostérone peut être transformée en périphérie et dans le testicule en 17-ß estradiol par un complexe enzymatique ubiquitaire : l’aromatase [7]. Dans le testicule humain mature, l’aromatase est essentiellement présente dans les cellules de Leydig [8]. L’importance des estrogènes chez l’homme dans le développement du tractus génital et la fertilité a été récemment mise en évidence [9].

Cependant, la production des hormones testiculaires est soumise à de nombreuses influences endocrines périphériques, notamment hypothalamo-hypophysaires [10]. Les taux plasmatiques de la circulation générale ne sont que le résultat de la balance entre la production hormonale testiculaire, leur catabolisme et leur utilisation par les tissus périphériques. De plus, la testostérone est aromatisée en périphérie en estradiol et il existe une production extragonadique d’estrogènes. Les valeurs dans le sang périphérique de la testostérone et de l’estradiol ne reflètent donc qu’imparfaitement la fonction endocrine testiculaire. Mesurer les taux plasmatiques de ces hormones testiculaires au niveau de la veine spermatique, le plus à proximité possible de leur lieu de synthèse, pourrait permettre d’avoir un témoignage plus fiable de leur production et d’évaluer cette production en fonction de l’état de la spermatogenèse.

Dans ce contexte, les objectifs de notre travail ont été de :

de comparer les valeurs des hormones testiculaires (testostérone, estradiol) mesurées dans le sang prélevé au niveau de la veine spermatique et dans le sang périphérique ;
d’étudier leur valeur prédictive de la présence de spermatozoïdes testiculaires extraits par biopsie chirurgicale chez des patients présentant une azoospermie non obstructive et candidats à une Assistance médicale à la procréation (AMP).

Cette étude pilote constitue une première approche de la valeur des hormones testiculaires en tant que marqueurs de l’état fonctionnel du tissu testiculaire. Elle s’inscrit dans un programme plus vaste d’étude des facteurs prédictifs potentiels de la présence de spermatozoïdes testiculaires chez les patients présentant une infertilité de cause non obstructive, avec pour finalité l’amélioration de la prise en charge des hommes de couples infertiles.


Matériel et méthodes


Type de l’étude


Étude pilote, prospective, comparative, sans bénéfice individuel direct, réalisée au sein du CHU de Rouen qui est le promoteur de cette recherche, sans groupe témoins.


Critères d’inclusion


Sujets de sexe masculin, âgés de 18 à 50ans, pris en charge dans le laboratoire de biologie de la reproduction de notre centre d’AMP pour une infertilité masculine liée à une azoospermie non obstructive par déficit testiculaire primaire et qui devaient bénéficier d’un prélèvement chirurgical de tissu testiculaire pour extraction de spermatozoïdes.


Critères d’exclusion


Un volume testiculaire inférieur à 5ml, une anomalie du caryotype, un traitement médical concomitant susceptible d’interférer avec la fonction testiculaire, une prise récente d’un traitement hormonal, une testostéronémie de base inférieure à 2ng/ml ont été considérés comme facteurs d’exclusion.


Critères d’évaluation


Le critère principal était la comparaison des taux plasmatiques de testostérone, 17 β estradiol mesurés dans la veine spermatique en fonction des résultats obtenus lors de la biopsie testiculaire (extraction positive ou négative).

Les critères secondaires étaient les suivants :

la comparaison des taux plasmatiques de testostérone, 17 β estradiol obtenus dans la veine spermatique avec ceux obtenus dans le sang périphérique chez les patients avec extraction de spermatozoïdes testiculaires positive et extraction de spermatozoïdes testiculaires negative ;
la comparaison des taux de testostérone et d’estradiol dans le sang spermatique et le sang périphérique en fonction de la concentration de spermatozoïdes, mobiles et totaux, évaluée sur les biopsies testiculaires.


Déroulement du protocole


La visite de préinclusion avait lieu lors de la consultation d’infertilité masculine et comprenait, outre un examen clinique complet, une échographie scrotale et un bilan sanguin et sérologique préopératoire habituellement requis pour toute ouverture de dossier d’autoconservation de spermatozoïdes avant AMP.

Le prélèvement de tissu testiculaire était effectué par voie chirurgicale sous anesthésie générale. Le prélèvement du sang du cordon était réalisé de façon unilatérale, à gauche, sur la plus volumineuse veine du plexus pampiniforme. La veine était cathétérisée par un cathéter 22G avec prélèvement de 1ml de sang veineux. Un échantillon de sang périphérique était prélevé à l’induction anesthésique. Les fragments de tissu testiculaire étaient immédiatement dilacérés de façon extemporanée dans un milieu de conservation (IVF®, Médicure, Lyon, France) et la suspension était analysée sous huile de paraffine détoxifiée (Médicult®, Lyon, France) à l’aide d’un microscope inversé. Les spermatozoïdes isolés étaient congelés en milieu cryoprotecteur sans jaune d’œuf (Spermfreeze®, JCD, Lyon, France). Le nombre de spermatozoïdes totaux et de spermatozoïdes mobiles extraits pour chaque testicule était calculé ainsi que la concentration (exprimée en nombre de spermatozoïdes par microlitre) de spermatozoïdes totaux et mobiles issue de chaque testicule.

Les dosages hormonaux étaient réalisés sur les échantillons sanguins préalablement centrifugés et conservés à −20°C par méthodes radio-immunologiques (Immunotech®, Beckman Coulter Inc., Fullerton, État-Unis : pour la testostérone ; DiaSorin®, Saluggia, Italie : pour l’estradiol). Tous les dosages hormonaux ont été effectués dans le même temps.


Taille de l’échantillon et analyses statistiques


Compte tenu du faible niveau de preuve concernant les valeurs des hormones testiculaires au niveau de la veine spermatique chez les patients infertiles, la taille de l’échantillon a été fixée arbitrairement à 30 patients. Les comparaisons des valeurs des hormones testiculaires mesurées dans la veine spermatique en fonction du résultat de l’extraction de spermatozoïdes ont été effectuées à l’aide du test de Mann-Whitney et le test de Wilcoxon (comparaison de moyennes par test non paramétrique adapté aux petits effectifs). Les corrélations entre les concentrations de spermatozoïdes totaux et mobiles et les dosages hormonaux dans le sang spermatique ont été effectuées à l’aide du test de corrélation de Spearman. Le seuil de significativité a été fixé à p <0,05.


Aspects légaux et éthiques


Tous les patients recevaient une lettre d’information et devaient signer un formulaire de consentement avant leur participation. Ce protocole a reçu l’accord du Comité de protection des personnes de Haute-Normandie.


Résultats


Trente-six patients présentant une azoospermie non obstructive et candidats à une AMP ont été inclus dans l’étude sur une période de 26 mois. Un patient présentait un critère d’exclusion (translocation robertsonnienne). Cinq patients sont sortis de l’étude en raison d’un échec de prélèvement sanguin spermatique. Trente patients ont été retenus pour l’exploitation des données. L’âge moyen était de 33 ans (22–50). Le volume testiculaire moyen était de 10,5 centimètres cube (cm3) à droite (5–21cm3) comme à gauche (2–22cm3). Treize patients (43 %) ont eu une extraction positive (groupe EP). Chez 11 de ces 13 patients, l’extraction était positive sur les deux testicules. L’extraction de spermatozoïdes testiculaires s’est révélée négative chez 17 patients (57 %) (groupe EN). Le volume testiculaire était plus faible (p =0,044) et les concentrations de FSH plus élevées (p =0,042) chez les patients avec extraction négative.

Les concentrations de testostérone, 17 β estradiol mesurées dans la veine spermatique et leur comparaison en fonction des résultats obtenus lors de la biopsie testiculaire figurent dans le Tableau 1. Aucune différence de concentrations d’estradiol et de testostérone dans la veine spermatique entre le groupe de patients avec biopsie positive et les patients avec biopsie négative n’a été révélée. En revanche, le rapport estradiol/testostérone dans la veine spermatique était significativement diminué dans le groupe de patients avec biopsie positive (p =0,018).

Les comparaisons entre les taux de testostérone et d’estradiol obtenus dans le sang spermatique avec ceux obtenus dans le sang périphérique, selon le résultat de la biopsie sont reportés dans le Tableau 2. Aucune corrélation n’a été mise en évidence pour les valeurs mesurées, que la biopsie testiculaire soit positive ou négative.

Par ailleurs, lorsque la biopsie était positive, aucune corrélation n’a été mise en évidence entre la concentration en spermatozoïdes totaux et mobiles et les concentrations de testostérone spermatique et périphérique. La concentration en spermatozoïdes totaux diminuait lorsque le taux d’estradiolémie spermatique augmentait, mais de façon non significative (p =0,0579). Une corrélation négative a été retrouvée entre le taux d’estradiol périphérique et la concentration en spermatozoïdes totaux (p =0,0374).


Discussion


L’idée de doser les hormones testiculaires dans le sang spermatique d’hommes infertiles est assez ancienne [11]. Cependant, il n’existe pas, à notre connaissance, de données disponibles concernant la comparaison des taux plasmatiques hormonaux au niveau spermatique selon la présence ou non de spermatozoïdes dans le tissu testiculaire. De plus, les données physiologiques laissent penser que les dosages périphériques d’estradiol et de testostérone habituellement utilisés en pratique clinique reflètent imparfaitement l’activité endocrine et paracrine du tissu testiculaire [10]. Il nous a donc semblé intéressant de développer une approche expérimentale prenant en compte les concentrations hormonales au niveau de la veine spermatique qui pourraient traduire de façon plus fiable la production hormonale testiculaire. Notre étude n’a pas mis en évidence de variation significative des taux de testostérone et d’estradiol plasmatiques entre les patients présentant une extraction de spermatozoïdes testiculaires positive et les patients présentant une extraction négative, que ces hormones aient été dosées dans le sang périphérique ou le sang du cordon. Cependant, nous avons retrouvé un rapport estradiol/testostérone significativement inférieur en cas de prélèvement de spermatozoïdes testiculaires positif lorsque ce rapport était établi dans le sang spermatique, par rapport au groupe de patients avec un prélèvement testiculaire négatif.

Le faible nombre de sujets inclus dans l’étude et la variabilité des résultats représentent des facteurs limitant. De plus, six échecs de prélèvement de sang spermatique sont à déplorer dans notre étude, soit un taux d’échec de 16,6 % (6/36). Néanmoins, le caractère prospectif de notre étude menée dans le cadre d’un protocole hospitalier de recherche clinique assure une certaine validité à notre recherche. Par ailleurs, la répartition des patients en terme d’âge, de concentrations hormonales périphériques, de volume testiculaire, est représentative de la population des hommes présentant une azoospermie non obstructive. Notre taux d’extraction positive (43 %) est également en accord avec celui habituellement retrouvé dans la littérature [1, 6].

La mesure du rapport estradiol/testostérone est un marqueur de l’activité aromatase intratesticulaire [7]. La diminution de ce rapport estradiol/testostérone dosé dans la veine spermatique en cas d’extraction positive pourrait suggérer que l’activité d’aromatisation testiculaire de la testostérone en estradiol serait moins importante en cas de spermatogenèse conservée, même de façon incomplète. On peut également émettre l’hypothèse que chez les patients présentant une azoospermie non obstructive à extraction négative, il puisse exister une surexpression du cytochrome P450 aromatase du fait de l’absence de cellules germinales. Les cellules germinales modulant l’expression de l’aromatase lorsqu’elles sont présentes [7, 12]. Cette hypothèse demande confirmation. En effet, jusqu’à présent, les données disponibles sur le rôle des estrogènes au sein de la reproduction masculine plaidaient plutôt en faveur d’un rôle bénéfique des estrogènes sur la spermatogenèse. Ainsi, d’après des données expérimentales, une absence d’activité aromatase serait délétère pour la fertilité [7]. C’est le cas des souris aromatase knock out (ArKO) qui présentent une infertilité progressive par arrêt de maturation des spermatides associé à une diminution de leur nombre, et par diminution de la mobilité des spermatozoïdes [13]. Chez l’homme, des déficiences en aromatase par mutation du gène ont été rapportées, avec des altérations de la spermatogenèse chez certains d’entre eux [7]. Une activité aromatase a également été retrouvée au niveau des spermatozoïdes, plus importante au niveau des spermatozoïdes mobiles [14]. Ces éléments plaident en faveur du rôle des estrogènes dans la maturation finale des cellules germinales et comme facteur anti-apoptose [15]. Parallèlement, des travaux ont montré qu’une activité excessive de l’aromatase pouvait avoir un effet délétère sur la spermatogenèse : des souris mâles transgéniques avec surexpression du cytochrome P450 aromatase sont infertiles et développent des tumeurs des cellules de Leydig [12]. Raman et Schlegel [16], dans une étude portant sur l’effet de deux inhibiteurs de l’aromatase chez des hommes infertiles, ont mis en évidence un effet bénéfique de ces deux molécules sur les paramètres spermatiques, avec une diminution du rapport estradiol/testostérone dans le sang périphérique. Toutefois, aucune modification n’était retrouvée au niveau du spermogramme après traitement, dans le groupe « azoospermie ».

Compte tenu des données publiées, il semble donc difficile de conclure sur le rôle néfaste de l’estradiol sur la spermatogenèse au vu des résultats de cette étude préliminaire. Cela renforce l’idée de prolonger cette thématique de recherche sur d’autres marqueurs tissulaires ou hormonaux pour affiner la compréhension des mécanismes incriminés dans l’activité estrogénique intratesticulaire, au niveau des interactions cellulaires paracrines, et dans la modulation des différents récepteurs. Ainsi, l’inhibine B, marqueur de la fonction des cellules de Sertoli, serait pour certains corrélée à l’état de la spermatogenèse [10, 17]. Cependant, son utilité comme facteur prédictif de l’existence de foyers de spermatogenèse résiduelle reste débattue [18]. La présence d’une microdélétion du chromosome Y serait un possible facteur péjoratif d’extraction de spermatozoïdes [19]. Toutefois, l’intérêt de l’étude des microdélétions du chromosome Y semble limité : ces anomalies chromosomiques ne touchent qu’environ 15 % des patients porteurs d’une azoospermie non obstructive ; et compte tenu de la fréquence de ces délétions dans la population azoospermique, les séries sont extrêmement limitées et des conclusions sont toujours difficiles à émettre [1]. L’hormone anti-müllerienne (AMH), produite par les cellules de Sertoli, semblerait contrôler chez l’adulte la prolifération des cellules de Leydig et la stéroïdogenèse et pourrait être corrélée à la prolifération des cellules germinales [17]. Des études ont mis en évidence un possible lien étroit entre le taux d’AMH dans le plasma séminal et l’état de la spermatogenèse, avec une concentration d’AMH dans le plasma séminal plus faible qu’en cas d’azoospermie non obstructive [17]. Cependant l’étude des concentrations séminales d’AMH et d’inhibine B ne permet pas de prédire, pour le moment, la positivité de l’extraction de spermatozoïdes testiculaires dans l’azoospermie non obstructive [17]. Enfin, l’identification de cellules haploïdes dans le sperme constitue une voie de recherche en développement. Une corrélation significative a été retrouvée entre la présence de spermatides dans le liquide séminal et le résultat de l’extraction testiculaire, que ce soit par cytologie classique (coloration au May-Grünwald-Giemsa) ou par cytométrie de flux [5].

Au total, notre approche expérimentale devra être validée sur un plus grand nombre de patients avec azoospermie non obstructive et en comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus sur un groupe témoin qui pourrait être constitué d’hommes infertiles par azoospermie obstructive et spermatogenèse normale relevant d’une ponction épididymaire. Cette approche hormonale devra être couplée à l’étude des marqueurs tissulaires précédemment abordés pour avoir une vision globale du fonctionnement testiculaire. Ainsi, la confirmation de ces hypothèses initiales pourrait conduire ultérieurement à la réalisation d’essais thérapeutiques d’anti-aromatases pour ce groupe de patients.


Conclusion


Notre travail a mis en évidence une potentielle diminution de l’activité aromatase intratesticulaire en cas de foyers de spermatogenèse conservée chez les hommes présentant une azoospermie non obstructive. Ces résultats préliminaires doivent être confrontés aux études actuellement en cours sur les autres marqueurs tissulaires testiculaires, en particulier l’étude de l’activité aromatase et de l’expression de son gène. Une meilleure compréhension de la physiopathologie des troubles de la spermatogenèse en cas d’azoospermie par déficit testiculaire primaire permettra d’affiner les indications de biopsie testiculaire chez les patients présentant une azoospermie non obstructive et candidats à l’AMP.



 Niveau de preuve : 3.





Tableau 1 - Comparaison des taux plasmatiques de testostérone et d’estradiol obtenus dans la veine spermatique en fonction des résultats de l’extraction de spermatozoïdes testiculaires.
Extraction de spermatozoïdes testiculaires  Tsa (ng/ml)  E2sa (pg/ml)  E2s/Ts 
Positive n =13 (43 %)  496,65 (9,45–1880)  1059,23 (28–5300)  0,002 (0,001–0,005) 
Négative n =17 (57 %)  358,18 (12–1126)  1310,88 (28–4850)  0,004 (0,001–0,009) 
p b  0,490  0,391  0,018 



Légende :
Ts : testostérone plasmatique dosée dans la veine spermatique ; E2s : estradiol plasmatique dosé dans la veine spermatique.

[a] 
Résultats exprimés en valeur moyenne (minimum–maximum).
[b] 
Significatif si p <0,05 (Mann-Whitney).


Tableau 2 - Comparaisons entre les taux de testostérone et d’estradiol obtenus dans le sang spermatique avec ceux obtenus dans le sang périphérique, en fonction des résultats de l’extraction de spermatozoïdes testiculaires.
  Extraction positive  Extraction négative  p b 
Tpa  4,55 (2,0–9,9)  4,7 (2,0–8,0)  0,932 
Tsa  496,65 (9,45–1880)  358,18 (12,0–1126)  0,946 
E2pa  21,08 (9–30))  26,47 (16,0–39,0)  0,296 
E2sa  1059,23 (28–5300)  1310,88 (28–4850)  0,229 



Légende :
Tp : testostérone plasmatique dosée dans le sang périphérique, exprimée en nanogramme par millilitre ; Ts : testostérone plasmatique dosée dans la veine spermatique, exprimée en nanogramme par millilitre ; E2p : estradiol plasmatique dosé dans le sang périphérique, exprimé en picogramme par millilitre ; E2s : estradiol plasmatique dosé dans la veine spermatique, exprimé en picogramme par millilitre.

[a] 
Résultats exprimés en valeur moyenne (minimum–maximum).
[b] 
Significatif si p <0,05 (test de corrélation de Spearman).


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