Biomatériaux et Génie Tissulaire en Urologie - PARTIE C : Génie tissulaire en urologie - Chapitre I : Thérapie cellulaire et Génie tissulaire en Urologie

15 juillet 2006

Mots clés : biomatériaux
Auteurs : Jean-Louis PARIENTE, Pierre CONORT, René YIOU, Benoît BARROU, Laurent ZINI
Référence : Prog Urol, 2005, 15, 5, 973-982

I. Introduction

L'appareil génito-urinaire peut être le siège d'anomalies congénitales, ou être exposé à des lésions d'origines traumatique, chirurgicale, infectieuse pouvant conduire à une perte de substance. Ces différentes lésions peuvent nécessiter une éventuelle reconstruction chirurgicale. Différentes techniques permettent l'utilisation de tissus propres à l'individu. Ces tissus peuvent être d'origine non urologique comme c'est le cas pour la peau, le tube digestif (exemple des remplacement vésicaux) ou divers lambeaux muqueux et quelquefois, dans le cas d'artifices techniques chirurgicaux, d'origine urologique, lambeau vésical, vessie unicorne...[22, 34, 40, 41, 42, 57, 60, 66, 76, 80, 81, 87, 97, 105, 115, 118, 129].

Cependant l'utilisation de tissus d'origine urologique devrait être privilégiée. En effet, l'utilisation de segments digestifs interposés dans la voie urinaire pour réaliser un remplacement vésical entraîne des complications métaboliques, une production de mucus important. L'utilisation de matériaux synthétiques pose des problèmes de bio-intégration avec notamment des risques infectieux et d'incrustations au niveau du matériau en contact directement avec l'urine [25]. Enfin d'autres essais ont été réalisés en utilisant des segments désépithélialisés de l'intestin [84].

Il paraît évident que la mise à disposition du clinicien, d'un tissu reconstruit et facile à mettre en oeuvre est une solution idéale. Cette attitude est déjà bien connue dans d'autres spécialités comme chez les grands brûlés, où des cultures de kératinocytes permettent d'obtenir rapidement une couverture des pertes de substance cutanées. Dans le domaine de la chirurgie vasculaire, des prothèses cellularisées sont implantées depuis 10 ans en clinique humaine avec des résultats probants notamment pour les prothèses de petit diamètre. Plus récemment l'injection dans le myocarde de cellules musculaires squelettiques a pu montrer sont efficacité dans le traitement de l'insuffisance cardiaque [82]. Le but du génie tissulaire est d'obtenir un tissu à partir des propres cellules du patient. Un biomatériau peut être utilisé pour supporter les cellules. On parle alors de thérapie cellulaire supportée, le matériau est appelé matrice. Il ne faut pas confondre les techniques d'implantations chirurgicales de matrices naturelles ou synthétiques acellulaires qui malheureusement sont souvent associées par abus de langage au génie tissulaire.

Ce type de procédure table sur la cicatrisation des tissus de l'hôte, sans que l'on puisse contrôler les types cellulaires qui apparaîtront ni la durée de cette cicatrisation ni le comportement de la matrice pendant cette période. Il ne s'agit en fait que d'une réparation dirigée.

Les cellules du patient peuvent également être directement injectées, sous forme de suspension, sans être organisées en tissu. On parle alors de thérapie cellulaire. Toutes ces techniques ont pu être développées grâce aux progrès réalisés en matière d'obtention de cellules différenciées d'origine humaine, urothéliales, musculaires lisses et endothéliale [4, 5, 8, 13, 14].

Les techniques de génie tissulaire peuvent se décomposer en cinq étapes :

- Pour la première étape, un prélèvement de tissus chez le patient est réalisé sous la forme d'une biopsie très limitée. On dissocie alors les différents types cellulaires : par exemple tissus épithéliaux d'une part et tissus musculaires lisses d'autre part ;

- La deuxième est une étape de prolifération cellulaire in vitro en utilisant des méthodes de cultures cellulaires. Les différents types cellulaires sont amplifiés et l'on peut ainsi obtenir une grande quantité de cellules; Toutes les procédures de culture in vitro doivent faire appel à des produits exempts de risques biologiques et dont la traçabilité est parfaite. En effet, les cellules devront être réimplantées chez l'homme. Si du sérum est nécessaire, on utilisera le sérum du patient lui-même. Les différents facteurs de croissance nécessaires doivent être recombinants.

- La troisième étape correspond au choix, guidé par des études de cytocompatibilité, d'un biomatériau destiné à supporter les cellules;

- Lors de la quatrième étape on associe les différents types cellulaires sur le support pour former le tissu composite ;

- Enfin, la dernière étape correspond à l'implantation chirurgicale.

La mise au point de ces techniques de génie tissulaire doit passer par une phase expérimentale d'implantation chez l'animal avant d'arriver en clinique humaine. Ceci impose de développer parallèlement ces modèles de cultures de cellules animales.

Depuis les 15 dernières années, de nombreux travaux concernant le génie tissulaire ont vu le jour. En Urologie, les publications concernent essentiellement des travaux in vitro ou in vivo chez l'animal. Chez l'homme, les travaux rapportés concernent des implantations de matrices acellulaires. Vraisemblablement dans un futur très proche, les premières études de thérapie cellulaire supportées démarreront en Urologie.

Pour des raisons didactiques, nous présenterons dans un premier temps les modèles cellulaires concernés, les biomatériaux utilisés ont été largement abordé dans le chapitre des matériaux biologiques et enfin les résultats obtenus aujourd'hui en thérapie cellulaire isolée ou supportée.

II. Cellules et cultures cellulaires

C'est l'essor du savoir faire en matière de cultures de cellules différenciées qui a permis le génie tissulaire. L'utilisation de cellules autologues permet d'éviter tout rejet. L'utilisation de cellules allogéniques ou xénogéniques ne présente que peu d'intérêt et nécessite une protection vis-à-vis du système immunitaire. A titre d'exemple, on peut citer les greffes de cellules de Langerhans d'origine animale, encapsulées dans un matériau dont les pores sont suffisamment fins pour empêcher le passage des immuno-globulines mais autoriser le passage de l'insuline et du glucose.

L'utilisation de cellules souches a été également rapporté et semble prometteuse. Ces précurseurs seraient plus résistants à l'ischémie que les cellules bien différenciées. Un des problèmes rencontrés en ingénierie tissulaire est justement l'installation d'une vascularisation des tissus reconstruits. Aujourd'hui les différents types cellulaires qui composent l'appareil Génito-Urinaire peuvent être cultivés in vitro avec des difficultés variables.

1. Urothélium

Les premiers travaux concernant la culture de Cellules Urothéliales Humaine remonte à une quinzaine d'année. L'utilisation de milieu de culture sans sérum et sans calcium permet d'obtenir des monocouches cellulaires à partir de fragments de muqueuse urothéliale saine. Trois techniques d'obtention des cellules ont pu être décrites : technique enzymatique par digestion des couches cellulaires épithéliales sous l'action de la collagénase type IV, technique des explants par dissection et fragmentation des prélèvements et technique par chélation du calcium qui donne les meilleurs résultats [93]. Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de culture adaptées et placées dans un incubateur. Le milieu de culture est renouvelé tous les deux jours jusqu'à la confluence. Lorsque la confluence est atteinte les cellules sont détachées puis réensemencés pour les sous-cultures dans des boites plus grandes. On peut ainsi amplifier leur nombre et leur surface de façon très importante. Les cellules urothéliales cultivées in vitro ont des caractéristiques de différenciation, de croissance et de survie, comparables à l'urothélium in vivo.

2. Cellules musculaires

a) Cellules musculaires lisses : Les premières descriptions de cultures de cellules musculaires lisses remontent à 1913. Depuis les techniques ont évolué. Il faut savoir que l'origine tissulaire du prélèvement influence grandement la technique d'obtention de cellules musculaires lisses. Deux types de techniques peuvent être décrites. Les explants où le tissu est disséqué, libéré de tout tissu conjonctif et épithélial. Ces explants sont placés au fond d'une boîte de culture. La deuxième technique décrite est le traitement enzymatique, où le tissu est digéré par une ou plusieurs enzymes choisies en fonction du site tissulaire initial. Les cellules obtenues sont mises en culture. Le pourcentage de sérum utilisé dans le milieu de culture modifie le phénotype (contractile ou sécrétoire), les propriétés électrophysiologiques et les capacités prolifératives des cellules musculaires obtenues [27, 28, 79, 103].

La culture de cellules musculaires lisses peut être associée à un autre type histologique comme des cellules endothéliales afin de favoriser la néovascularisation de l'organe reconstitué.

b) Cellules musculaires striées : Les premières descriptions de cultures de cellules musculaires remontent à 1979. Ces cellules peuvent être obtenues à partir d'une biopsie musculaire d'un muscle strié squelettique. On isole dans cette biopsie grâce à une technique enzymatique (collagénase et trypsine) dans cette biopsie des cellules musculaires satellites immatures appelées myoblastes et capables de se multiplier. Ces myoblastes sont amplifiés en culture à l'aide d'un milieu enrichi en sérum. Les sous-cultures sont réalisées précocement à 50% de confluence de façon à éviter leur différenciation. Les cultures sont purifiées à l'aide d'une technique d'anticorps monoclonaux fixés sur des microbilles magnétiques. Ces cellules sont assez résistantes à l'ischémie [24, 106].

3. Cellules endothéliales

Les cellules endothéliales peuvent être obtenues à partir d'un fragment de veine. Ce fragment de veine est canulé aux deux extrémités, puis rincé avec du milieu de culture afin d'éliminer le sang résiduel. La veine est ensuite remplie d'une solution de collagénase à 0,1 % pour ne récupérer que des cellules endothéliales sans fibroblastes ni cellules musculaires lisses contaminantes (Figure 1).

Figure 1 : Canulation et lavage avec une solution de collagénase, d'une veine saphène en vue de récupérer les cellules endothèliales.

Après incubation, la suspension cellulaire est collectée, centrifugée et le culot repris dans du milieu de culture puis ensemencé. Les sous-cultures sont envisagées à 90 % de confluence.

4. Chondrocytes

La culture de chondrocytes est décrite depuis 1967. Un petit prélèvement de cartilage est dissocié par un procédé enzymatique (pronase et collagénase) et permet d'obtenir une suspension de chondrocytes qui est filtrée puis mise en culture. Un milieu avec ou sans sérum peut-être utilisé [26, 50, 78].

5. Cellules souches circulantes ou de la moelle osseuse et cellules embryonnaires

Les cellules souches représentent aujourd'hui un enjeu scientifique majeur et leur utilisation dans le cadre de nouvelles thérapies semble ouvrir de belles perspectives. Il en existe quatre types. Les cellules souches unipotentes ne peuvent former qu'une sorte de cellule différenciée. Ce sont par exemple les kératinocytes de la peau. D'autres, dites multipotentes, sont à l'origine de plusieurs types de cellules différenciées [19].

Les plus connues sont les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse, à l'origine de toutes les cellules sanguines (globules rouges et blancs, plaquettes, etc.). Les cellules souches mésenchymateuses, quant à elles, se révèlent capables de produire les chondroblastes (futures cellules cartilagineuses), les myoblastes (futures cellules musculaires) et les adipoblastes (futures cellules adipeuses). Cependant, l'intérêt se porte avant tout sur les cellules souches pluripotentes, plus communément appelées cellules souches embryonnaires. Issues de la partie interne du blastocyste (au stade de quarante cellules), elles peuvent engendrer tous les tissus de l'organisme (soit près de deux cents types de cellules) mais pas un être humain dans son entier [22, 39, 107].

Face aux obstacles éthiques et scientifiques qui se dressent devant l'acquisition des cellules souches embryonnaires, certains préconisent l'emploi des cellules souches adultes, unipotentes ou multipotentes. Prélevées au niveau médullaire ou tissulaire sur un adulte, ces cellules souches ne posent aucun problème d'ordre éthique. Deux écueils néanmoins : contrairement aux cellules souches embryonnaires, elles ne peuvent pas se multiplier indéfiniment et certains tissus, comme le coeur ou le pancréas, en sont dénués. Vraisemblablement dans les années qui viennent, l'utilisation des cellules souches se développera [62, 122].

III Biomatériaux impliques dans le genie tissulaire : Les matrices extracellulaires

Ces biomatériaux sont utilisés comme support pour les cellules. On parle alors de matrices extracellulaires. Cette association permettant de reconstituer le tissu. Les matériaux élus doivent être plus ou moins biodégradables (selon l'application) et surtout parfaitement biocompatibles afin de favoriser l'adhésion et la prolifération cellulaire à leur contact. La biocompatibilité de ces matrices doit être évaluée comme pour tout autre matériau [3, 90, 91, 92, 93].

Plusieurs types de biomatériaux sont actuellement disponibles et ils peuvent être classés en deux catégories :

- Les matériaux d'origine naturelle : sous-muqueuse vésicale, intestinale (lyophilisée ou non), collagène, alginate [35, 43, 44, 89, 113, 114, 128]

- Les matériaux polymériques synthétiques : acide poly-glycolique (PGA), acide poly-lactique (PLA) et acide poly-lactico-glycolique (PLGA) [46]. Ces matériaux peuvent être utilisés directement ou fonctionnalisés à l'aide de peptides (exemple : peptides RGD, Arginine - Glycine - Acide Aspartique) et/ou de facteurs de croissance par exemple, de façon à favoriser l'adhésion et/ou la prolifération cellulaire [36].

Pour améliorer les caractéristiques mécaniques du matériau on peut associer plusieurs matériaux comme, par exemple, un matériau à résorption plus lente avec un matériau à résorption plus rapide ou un matériau naturel avec un synthétique de façon à se rapprocher des propriétés de l'organe que l'on souhaite reconstituer [51, 55, 96, 108, 120, 143]. Les matériaux naturels ont bien sûr un avantage potentiel en raison de leur reconnaissance biologique ; un chapitre leur a été consacré.

Les matériaux synthétiques ont l'avantage de leur reproductibilité à large échelle, du contrôle de leur résistance et de leur dégradation et de l'absence de risque biologique.

IV. Thérapie cellulaire

Dans ce domaine, il s'agit le plus souvent de cellules normales, non-modifiées, simplement amplifiées in vitro à partir d'un petit prélèvement, puis réimplanté le plus souvent sous forme de suspension cellulaire. Bien sûr les progrès de la thérapie génique permettra dans un futur proche de modifier les cellules avant leur ré-injection et de corriger ainsi une éventuelle anomalie [135].

1. Reflux vésico-urétéral

Une des premières applications cliniques a été le traitement du reflux vésico-urétéral par injection endoscopique sous le méat urétral de chondrocytes d'origine auriculaires autologues en suspension dans un gel d'alginate [11].

Ces chondrocytes remplissent les conditions d'un matériel d'expansion volumique injectable idéal : biocompatible, stable, sans migration, et utilisable chez l'homme. Efficace à long terme sur un modèle animal, cette technique a alors été appliquée à l'homme. Vingt-neuf enfants ayant un reflux de stade II à IV ont été traités avec un taux de réussite à court terme de 83 % (24 des 29 enfants) et sans complication.

2. Insuffisance sphinctérienne urétrale

L'amélioration des méthodes de culture de cellules musculaires striées, et l'obtention de myoblastes (cellules musculaire précurseur) à partir d'un prélèvement de muscle strié à été utilisé en clinique humaine dans le traitement de l'insuffisance cardiaque d'origine ischémique [32, 49, 82, 86, 112, 125]. Des résultats très encourageants ont été obtenus. Cette approche de thérapie cellulaire a pu être transposée à l'incontinence urinaire. En effet, l'insuffisance sphinctérienne est souvent responsable de l'échec de la chirurgie de l'incontinence [48, 77] et jusqu'à présent dans ce cas, le sphincter artificiel représentait la seule solution thérapeutique [119]. Augmenter le nombre de fibres musculaires sphinctériennes fonctionnelles par une injection de cellules précurseurs musculaires autologues (CPM) apparaît être une solution prometteuse [29, 59, 73]. Ces techniques ont été inspirées par les découvertes réalisées dans le cadre de la recherche sur les myopathies génétiquement déterminées, au premier rang desquelles figure la myopathie de Duchenne [54, 95]. Bien que les essais de greffe de cellules précurseurs musculaires chez des patients atteints de la maladie de Duchenne se soient soldés par des échecs [83], la recherche en thérapie cellulaire pour les myopathies a apporté des espoirs de traitement considérables pour d'autres pathologies musculaires acquises. L'insuffisance cardiaque ischémique est historiquement l'une des premières indications de l'injection de cellules précurseurs musculaires pour un déficit musculaire localisé [82]. On peut cependant noter que si la greffe intracardiaque de cellules précurseurs musculaires (associée à un geste de revascularisation) a montré un intérêt certain chez les premiers patients, son mécanisme d'action reste encore débattu [74]. Certaines de ces hypothèses remettent en cause le type de cellules à injecter.

Les premières greffes de cellules précurseurs musculaires chez l'homme pour traiter l'incontinence urinaire on été effectuées par Strasser et al. [122] d'une manière assez complexe : des cellules précurseurs musculaires (myoblastes) et des fibroblastes ont été injectés, en suspension dans du collagène, sous contrôle échographique, et séparément dans des zones différentes de la paroi urétrale. L'injection de fibroblastes a été justifiée par les auteurs pour traiter une atrophie de la sous-muqueuse urétrale. Trente-cinq des 42 patients traités dans cet essai étaient guéris de leur incontinence un an après la greffe. La problématique de la greffe intra-urétrale de cellules précurseurs musculaires est complexe et spécifique. Les principales notions à prendre en compte sont les suivantes :

a) Une greffe de cellules précurseurs musculaires est-elle justifiée en cas de dénervation sphinctérienne ?

L'insuffisance sphinctérienne urétrale est souvent associée à un certain degré de dénervation musculaire et de fibrose sur des arguments à la fois histologiques [56] et électrophysiologiques [102]. Or, l'état d'innervation est un facteur décisif dans le processus de régénération des muscles striés squelettiques [67, 130]. Des études utilisant des systèmes co-culture de cellules précurseurs musculaires et de moelle épinière de rat ont montré que les cellules précurseurs musculaires exercent une action trophique sur les motoneurones qui est nécessaire à leur survie [52, 53, 127]. Ainsi, dans le cas précis de l'insuffisance sphinctérienne par dénervation chronique la greffe de cellules précurseurs musculaires pourrait trouver une justification originale consistant à activer la régénération nerveuse urétrale.

b) Quel est le devenir des cellules injectées dans la paroi urétrale ?

Seules moins de 3% des cellules musculaires injectées dans un muscle, ont un réel potentiel myogénique [136, 141]. Les cellules survivantes ont classiquement des caractéristiques physiques et phénotypiques de cellules souches. Deux hypothèses peuvent être envisagées: les cellules précurseurs musculaires peuvent soit fusionner avec les fibres musculaires sphinctériennes préexistantes comme l'a montré Peyromaure [98] ou bien suivre un processus de différenciation myogénique complet [131, 132]. L'injection de cellules précurseurs musculaires dans une zone de la paroi urétrale dénuée de fibres (légèrement à distance du sphincter ou dans une zone sphinctérienne entièrement détruite), pourrait en revanche permettre aux cellules d'évoluer suivant un processus de différenciation myogénique complet avec prolifération puis fusion et formation de nouvelles fibres musculaires. Mais se pose alors le problème de leur innervation [132].

c) Une greffe de cellules précurseurs musculaires peut-elle améliorer le tonus musculaire urétral ?

Il s'agit de la principale inconnue. Il semble fondamental de déterminer si l'injection de cellules précurseurs musculaires peut réellement renforcer la tonicité musculaire sphinctérienne ou bien si son mode d'action est simplement celui d'un effet de volume.

d) Quelle quantité et quel type de cellules précurseurs musculaires faut il injecter ?

De nombreux travaux ont montré que la très faible quantité de cellules précurseurs musculaires contenues dans le muscle à l'état basal (2.105 à 3.105 par gramme de muscle strié soit approximativement 1010 à 2x1010 dans le corps humain) peut à elle seule suffire à faire régénérer intégralement un muscle après une lésion [116, 133]. L'injection intra sphinctérienne de 5x106 cellules précurseurs musculaires, soit près de cent fois plus que le nombre normal de cellules précurseurs musculaires sphinctériennes avant lésion, ne permet de récupérer que 40 % de la fonction basale [130]. Dans le cadre de la greffe intracardiaque, plusieurs équipes ont proposé la greffe de CPM non cultivées. Ce mode d'administration aurait l'énorme avantage de pouvoir être pratiqué exclusivement en salle d'opération et d'éviter une phase d'expansion en incubateur. Dans une étude récente [134], Yiou et al ont montré que des cellules précurseurs musculaires, ayant des caractéristiques de cellules souches, injectées seules, dans un sphincter entièrement détruit survivent mais restent mononuclées et ne se différentient pas en fibres musculaires (Figure 2).

Figure 2 Injection fractionnée de CPM dans un sphincter strié urétral de rat mâle préalablement détruit par électrocoagulation. A : l'injection d'une population hétérogène de CPM à différents stades de maturation (immatures+ différenciées) et marquées avec un adénovirus béta-galactosidase aboutit à la formation de nouvelles fibres musculaires révélées par une solution de X-gal (couleur bleue). B : les CPM immatures (cellules souches musculaires) injectées seules après avoir écarté les CPM différenciées survivent à l'injection mais sont incapables de se différencier en fibres musculaires matures. C : les CPM différenciées injectées seules après retrait des CPM immatures ne survivent pas à l'injection. Cette expérience montre que la présence de CPM à différents stades de maturation est nécessaire à la formation de nouvelles fibres musculaires. Les CPM différenciées ont probablement la faculté d'orienter les CPM souches vers une lignée myogénique (grossissement : X10).

Inversement, les cellules précurseurs musculaires matures injectées en l'absence de cellules précurseurs musculaires « souches » ne survivent pas et n'ont donc aucun effet. Enfin, lorsque les deux types de cellules sont réunis, on assiste à la formation de fibres musculaires innervées fonctionnelles. Ceci suggère que dans un contexte de lésion musculaire chronique qui caractérise l'insuffisance sphinctérienne, l'injection de cellules précurseurs musculaires à différents stades de maturation est préférable à l'injection de cellules précurseurs musculaires hyperpurifiées. Les cellules les plus matures, bien qu'ayant une survie limitée ont probablement la faculté d'orienter la différenciation des cellules précurseurs musculaires immatures et résistantes vers une lignée musculaire.

3. Thérapie cellulaire et transplantation pancréatique [20, 21, 75, 121]

L'idée de recourir à la thérapie cellulaire pour traiter le diabète n'est pas nouvelle puisque la première tentative date de 1893. En 2005, même si de nombreux progrès ont été réalisés, on ne peut encore considérer que la méthode est parfaitement validée. Le siècle écoulé aura vu se succéder enthousiasme et découragement. Les îlots pancréatiques, seuls responsables de la sécrétion endocrine du pancréas, représentent, une fois isolés, le volume d'un dé à coudre et leur greffe se fait par simple injection dans le système porte, par voie percutané le plus souvent. Les résultats étaient décevants jusqu'à récemment (moins de 10% des patients insulino-indépendants à un an) pour de multiples raisons : site d'implantation inapproprié, nombre insuffisant d'îlots, traitement immunosuppresseur (notamment les corticoïdes) toxique pour les îlots, rejet aigu pour lequel on ne dispose d'aucun marqueur pour ne citer que les principales.

Toutefois, une équipe canadienne a redonné espoir en publiant en 2000 une courte série de 7 malades traités par greffe d'îlots qui ont tous pu arrêter leurs injections d'insuline. La particularité de cette expérience était double : d'une part l'emploi de nouveaux immunosuppresseurs moins toxiques en terme d'insulinosécrétion, d'autre part une greffe précoce avant que le diabète n'ait eu le temps de créer des lésions irréversibles notamment des petits vaisseaux. La qualité de ces résultats a conduit plusieurs équipes à reproduire ce schéma de traitement et l'on peut considérer que le taux d'insulinoindépendance à 1 an peut atteindre 75% dans des mains entraînées. Malheureusement, l'analyse des résultats à 5 ans publiée au début de l'année est décevante. Seuls 10% des 65 patients greffés par l'équipe canadienne restent insulinoindépendants à 5 ans, et la durée moyenne de maintien de l'insulinoindépendance a été de 15 mois (6,2 à 15,2 mois). Il faut noter toutefois que 80% d'entre eux ont conservé une sécrétion endogène d'insuline comme en témoigne la présence de peptide C. Cette sécrétion, insuffisante pour se passer d'insulinothérapie, permet toutefois d'obtenir une qualité d'équilibre glycémique qu'il est pratiquement impossible d'obtenir avec la seule insulinothérapie. La greffe d'îlots de Langerhans ne permet donc pas encore d'obtenir des résultats équivalents à ceux de la transplantation de pancréas vascularisé et ne peut être proposée dans les mêmes indications.

De nouvelles approches d'ingénierie tissulaire renforcent l'espoir de voir la thérapie cellulaire devenir un traitement de routine du diabète.

1) Une équipe israélienne a démontré qu'il était possible, chez la souris, d'obtenir des îlots à partir de cellules souches des canaux excréteurs du pancréas. On pourrait ainsi imaginer de "faire pousser" au laboratoire des îlots à partir de certaines cellules souches du pancréas du patient. Une fois greffés, ces îlots ne seraient pas reconnus comme étrangers par le système immunitaire puisque dérivés du patient lui-même et le traitement immunosuppresseur deviendrait inutile.

2) Une équipe américaine a, elle, démontré chez la souris la possibilité de "reprogrammer" des cellules hépatiques pour leur faire sécréter de l'insuline. Là encore, le traitement immunosuppresseur serait inutile puisque ces cellules "reprogrammées" seraient autologues.

Ces travaux ont été repris par diverses équipes qui confirment qu'il peut être possible de générer des îlots fonctionnels à partir de cellules souches. Le chemin jusqu'aux premiers essais sur l'homme est encore long. Toutefois l'espoir est grand de pouvoir un jour traiter le diabète par une simple greffe d'îlots (ou de cellules sécrétant de manière régulée de l'insuline) sans aucun traitement immunosuppresseur, et ce dès le début de la maladie.

V. Génie tissulaire

Reconstruire complètement un tissus in vitro. est aujourd'hui techniquement réalisable. L'implanter et obtenir son intégration représente un challenge. Il persiste encore des questions concernant notamment la vascularisation du tissu obtenu, et la stabilité dans le temps des cellules mises en culture. Aujourd'hui de nombreux travaux in vitro et in vivo chez l'animal ont pu être conduit et l'évaluation des résultats obtenus doit être encore humble dans l'intérêt des patients. Dans les années à venir, seules quelques applications vont arriver en clinique humaine [15, 45, 85].

1. Urètre et Uretère

Les matrices ensemencées in vitro par des cellules autologues, puis implantées in vivo donnent des résultats beaucoup plus intéressants que l'utilisation de biomatériaux seuls [30, 31, 68, 69, 70, 72]. Les travaux conduits par Atala, réalisé dès 1992, ont permis de montrer pour la première fois qu'il était possible d'obtenir in vitro un tissu composite de novo à partir de cellules de la voie urinaire de la souris. En ensemençant des cellules urothéliales et des cellules musculaires lisses amplifiées in vitro, puis en implantant, chez la Souris athymique, différentes matrices extra-cellulaires, on obtient un tissu de bonne qualité et homogène [16, 17]. Des analyses histologiques permettent de montrer qu'après implantation, les cellules restent vivantes et s'orientent elle-même dans l'espace [7, 10, 18, 37, 38 117]. Une activité angiogénique est observée dès le cinquième jour. En cinquante jours environ, on retrouve un urothélium organisé en multicouche et un tissu musculaire de qualité.

Ce type de technique permet également d'obtenir une structure tubulaire. Un segment entier peut alors être remplacé et cela est particulièrement intéressant pour l'uretère car aucune sténose n'a été observée chez l'animal. L'implantation en continuité avec l'uretère chez le chien [138], de structures tubulaires cellularisées, formées à partir d'une matrice hétérologue (sous-muqueuse vésicale de Porc), permet d'obtenir un tissu urétéral fonctionnel. Les problèmes rencontrés lors des reconstructions urétérales, sont souvent liés à des soucis de densité cellulaire qui peut ne pas être homogène entraînant des rétractions ou des incrustations. Des difficultés de vascularisation du biomatériau hybride peuvent aussi être rencontrées en particulier si les segments sont longs. L'association de cellules endothéliales aux cellules musculaires lisses facilite la néo-angiogenèse [61, 63, 123].

2. Vessie

Différents travaux faisant appel au génie tissulaire, ont pu être conduits notamment chez le chien beagle. La cystoplastie d'agrandissement réalisée, à l'aide d'un matériau cellularisé, permet d'obtenir une augmentation de capacité très importante par rapport à ce qui peut être obtenu à l'aide d'un matériau non cellularisé (de 99 % versus 30 %). L'équipe d'Anthony Atala [88], a pu montrer l'intérêt d'un remplacement vésical réalisé selon une technique de génie tissulaire. Dans cette étude, 3 groupes avaient été réalisés : une reconstruction classique, une reconstruction avec une matrice acellulaire, et une reconstruction à l'aide d'une matrice ensemencée de cellules urothéliales et de cellules musculaires.

Les animaux ont été suivis à 1, 2, 3, 4, 6, 11 mois. Les capacités respectives à 11 mois ont été de 24, 46, 95 % démontrant l'intérêt de la matrice cellularisée. Il en va de même pour la compliance où les résultats étaient de 10, 42, 100 % de la compliance pré-opératoire. Cette étude démontre, chez l'animal, la faisabilité et l'intérêt d'un remplacement vésical par thérapie cellulaire supportée et incite à poursuivre dans cette voie pour une application en clinique humaine [1,6, 12, 58, 99, 100, 104, 109, 124, 126, 142].

Au cours d'une étude in vivo chez la brebis, non publiée, nous avons pu reconstituer in vitro en dix jours de culture, un tissu en trois dimensions associant une matrice extracellulaire en collagène, des cellules musculaires lisses et des cellules urothéliales (Figure 3). Un agrandissement vésical a pu être alors réalisé (Figure 4) et nous avons pu obtenir l'intégration complète du néo-tissu confirmant ainsi ces résultats.

Figure 3 : Multicouche de cellules urothéliales développées sur la matrice en collagène. Les cellules urothéliales sont marquées par des anticorps anti-cytokératines.
Figure 4 : implantation chirurgicale, chez la brebis, sous la forme d'un agrandissement vésical, d'un tissu multicouche associant une matrice en collagène, des cellules urothéliales (face luminale) et des cellules musculaires lisses (face externe).

3. Rein

L'épuration extra-rénale au cours de séances d'hémodialyse, a été rendue possible grâce à des membranes semi-perméables qui sont de véritables biomatériaux. Aujourd'hui l'élaboration de tels filtres est de plus en plus sophistiquée notamment pour améliorer la qualité de l'épuration. Associer des cellules à ce type de structure apparaît donc logique dans une démarche de génie tissulaire, mais la structure rénale est très complexe à reproduire. L'objectif d'un organe bio-artificiel est ici principalement la production d'urine et non les fonctions endocriniennes du rein.

La culture de cellules glomérulaires en trois dimensions permet d'obtenir de nouveaux glomérules capables de filtrer une urine primitive et d'excréter des concentrations élevées d'acide urique et de créatinine. L'association à de telles structures glomérulaires, de tubes de polysulphone ensemensés par des cellules tubulaires et endothéliales permettra d'améliorer encore la fonctionnalité en particulier pour l'excrétion et la réabsorption d'eau et de sel. [33, 138]. Cependant ces travaux sont encore au stade expérimental et il faut espérer pouvoir arriver, dans les années à venir, à un organe hybride bioartificiel [9, 47, 101].

4. Organes génitaux externes

Comme pour l'appareil urinaire, de nombreuses lésions acquises ou congénitales peuvent toucher les tissus d'origine génitale.

Récemment, Schultheiss [110, 111], a rapporté la réalisation d'un tissu fibreux autologue par génie tissulaire utilisable comme matériau de réparation pour le traitement de la maladie de Lapeyronie. La possibilité d'obtenir un tissu caverneux autologue faciliterait grandement les possibilités de reconstruction chirurgicale et peut-être même de traitement des dysfonctions érectiles, les travaux concernant ce domaine sont encore au stade de la recherche, mais la faisabilité maintenant a été démontrée.

A partir d'une biopsie chirurgicale de tissu caverneux, pratiquée lors de l'implantation d'une prothèse pénienne, la culture de cellules musculaires lisses du corps caverneux a pu être réalisée. Les cellules obtenues expriment l'alpha-actine. Des modèles plus complexes (co-cultures) ont pu être conduits en associant des cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales, le tout ensemencé sur un polymère puis implanté in vivo. Après 42 jours d'implantation, une organisation similaire à un corps caverneux normal a pu être obtenu [71]. On pourrait imaginer ainsi dans le futur maîtriser l'élaboration d'un nouveau corps caverneux.

5. Cas Particulier : création de prothèse

La création d'une prothèse pénienne à partir de tissu autologue est possible. On évite ainsi les problèmes d'infection et d'érosion. Une telle procédure a été proposée en utilisant des chondrocytes ensemencés sur une matrice. On peut obtenir ainsi une prothèse autologue résistante sur le plan mécanique [139, 140].

Enfin, des prothèses urétrales ont pu être développées, sans application clinique réelle, à partir de ces cultures de chondrocytes ensemencés sur une matrice tubulaire polymérique [2]. Ceci démontre plus la faisabilité de telles prothèses dont les caractéristiques biomécaniques (élasticité et résistance à de fortes pressions) étaient satisfaisantes.

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