Analyse moléculaire et cytométrique des cellules d'adénocarcinome rénal. Concepts, techniques et perspectives.

16 avril 2003

Mots clés : Rein, adénocarcinome, marqueurs biologiques.
Auteurs : LI G., LAMBERT C., GENTIL-PERRET A., GENIN C., TOSTAIN J.
Référence : Prog Urol, 2003, 13, 1-13
Nous ne disposons pas, actuellement, de marqueur biologique fiable pour le diagnostic et le pronostic de l'adénocarcinome rénal à cellules conventionnelles (ARCC). Or, 20% environ des tumeurs de petit volume détectées par les nouvelles techniques d'imagerie sont bénignes. Enfin, l'évolution est difficilement prévisible, avec des différences considérables pour le même stade et le même grade. L'identification moléculaire des cellules d'ARCC pourrait répondre à ces exigences nouvelles dans le cadre du diagnostic des tumeurs rénales atypiques ou de petit volume et permettre d'affiner un pronostic actuellement incertain.
Parmi les antigènes utilisables pour le diagnostic moléculaire d'ARCC, certains sont présents dans le rein normal comme Cadhérine-6. D'autres sont des antigènes néoformés (TuM2PK, MN/CA9, CA12, calpaine) ou ectopiques (PSMA, PSA, KLKI, cytokératine 7) ou entraïnant une glycosylation anormale (sialyl Lewis X, galectines) qui marquent le caractère tumoral. La capacité de progression de la tumeur est liée à des dysrégulations du cycle (ras, Pax2, Tiam 1, waf /p21), de la division (cyclines, MIB1, PCNA, Ag Nor), de l'apoptose (bcl2, P53, CD95/Apo1), des capacités d'invasion tissulaire (protéases), de désorganisation (cadhérine, caténines) ou de nidation (ICAM-1, CD44). Enfin, des anomalies chromosomiques (mutations, translocations) apparaissent. MN/CA9, cadhérine-6, vimentine, mucine1 et le contenu en ADN sont particulièrement intéressants pour le diagnostic et/ou le pronostic de l'ARCC. Ces marqueurs peuvent être analysés par des méthodes cytométriques (en flux, en plaque) ou moléculaires (RT-PCR, hybridation in situ) extrêmement sensibles. Ces techniques permettent d'abaisser les seuils de détection de cellules tumorales dans les produits biologiques (cytoponction, micro-biopsie) voire, à terme, dans le sang circulant. Les méthodes en protéomique et en génomique (biopuces) devraient accélérer considérablement la recherche dans ce domaine avant d'avoir des applications cliniques de routine.

Le diagnostic anatomo-pathologique d'adénocarcinome à cellules rénales conventionnelles (ARCC) reste indispensable après exérèse chirurgicale. Toutefois, la fréquence grandissante des tumeurs asymptomatiques de petit volume, dont 20% environ sont bénignes [1], l'existence de kystes atypiques et le contrôle des nouvelles techniques de destruction tumorale in situ (radiofréquence et cryochirurgie percutanées, ultra-sons focalisés...) nécessitent dorénavant un diagnostic de certitude avant et parfois après traitement que ne permettent pas de façon constante les techniques d'imagerie et/ou les prélèvements cytologiques ou biopsiques percutanés. C'est dire l'intérêt de méthodes qui permettraient l'identification moléculaire des cellules d'ARCC sur des prélèvements percutanés paucicellulaires, voire sur un simple prélèvement sanguin périphérique détectant les cellules tumorales circulantes. L'identification biologique des cellules, répondant aux exigences modernes d'économie (rapidité et moindre coût) et d'assurance qualité (précision, sensibilité, reproductibilité), est encore débutante. De nombreux progrès ont été effectués pour les cellules hématopoiétiques mais beaucoup moins pour les cellules d'autres tissus. Le problème est encore plus complexe pour l'identification de cellules tumorales caractérisées par leur dédifférenciation, leur tendance à la monstruosité et l'hétérogénéité.

Dans la problématique d'identification moléculaire des cellules d'adénocarcinome rénal, trois objectifs diagnostiques sont à atteindre :

1. savoir différencier une cellule maligne d'une cellule saine (marqueurs de malignité),

2. identifier l'origine rénale de la tumeur (marqueurs d'origine) par rapport à d'autres tissus, notamment ganglionnaires ou hématopoiétiques,

3. identifier des critères d'agressivité de la tumeur (marqueurs pronostiques, risque métastatique, sensibilité aux traitements).

La présente revue cherche à faire le point sur les connaissances actuelles concernant les marqueurs biologiques de l'ARCC et à mettre en perspective les différentes méthodes utilisant ces outils.

MARQUEURS MOLECULAIRES ET CYTOMETRIQUES DE L'ARCC

Antigènes exprimés par toute cellule épithéliale

Toutes les cellules épithéliales expriment des antigènes membranaires absents sur les autres types cellulaires notamment hématopoiétiques :

- l'antigène épithélial membranaire (EMA, Muc1 ou Episialine) qui se présente sous plusieurs isoformes : membranaire (Rep), sécrété (Sec) ou tronqué (X, Y, Z) et une glycoforme produite par la cellule tumorale (CA 15.3) ;

- l'antigène spécifique d'épithélium (ESA, Ep-CAM, HEA125, Ber-EP4) ;

- et l'antigène relié aux épithéliums (ERA, MOC 31).

Tous peuvent être exprimés par la cellule rénale saine. La cellule tumorale exprime à priori ces antigènes mais souvent avec une intensité qui diminue avec la dédifférenciation et donc l'agressivité de la tumeur. Avec des techniques quantitatives, ces outils d'identification pourraient revêtir une valeur diagnostique de malignité, voire une valeur pronostique.

De la même façon, la cellule épithéliale rénale exprime:

- des protéines du cytosquelette telles que les cytokératines (notamment les isoformes CK8 et CK19) qui ont été retrouvées dans l'ARCC [2, 3] ;

- des protéines qui participent à l'organogénèse et à la cohésion tissulaire par adhérence homotypique intercellulaire ou de cellule à matrice extracellulaire : les cadhérines (surtout la cadhérine 6) [4-6], les caténines qui la relient au cytosquelette [6-8] ou la vinculine [9]. Leur expression peut être réduite dans le tissu tumoral ce qui contribuerait à la désorganisation tissulaire et au risque métastatique. De plus, des anomalies fonctionnelles des protéines peuvent déstabiliser le système a-caténine-cadhérine sans modifier obligatoirement la quantité de protéine exprimée [7, 8].

Cadhérine-6 semble un marqueur très spécifique du parenchyme rénal [7]. Ce gène, très majoritairement exprimé dans le TCP, le reste dans l'ARCC et peut être utilisé comme marqueur diagnostique et pronostique [8]. Nous avons analysé par RT-PCR une série d'échantillons de sang périphérique de témoins sains et de patients porteurs d'ARCC [10]. Chez les témoins, 2/17 étaient positifs (11,7%). Chez les porteurs d'ARCC, la recherche était positive chez 16/31 (51.6%) et atteignait 6/8 (75%) chez les patients M+ ou N+.

La cellule tubulaire rénale a une grande activité enzymatique que l'on peut détecter morphologiquement : l'Amino-Peptidase A (gp160) [11, 12], N (répertoriée à la nomenclature : CD13 [13]). L'endopeptidase neutre (CD10) [14, 15] et la Dipeptidyl Peptidase IV (CD26) [13] sont exprimées dans le TCP, mais également d'autres tissus comme le côlon, le synoviocyte et même le lymphocyte T. Leurs expressions peuvent être conservées dans l'ARCC, souvent à une moindre intensité et avec une perte de distribution apicale pour une répartition plus périphérique en amas [13], modulable par les cytokines endogènes ou thérapeutiques [16].

D'autres protéines sont spécifiques du TCP : une protéine associée à la bordure en brosse (gp200) [17], la kinase diphosphate nucléosidique A (NPKA- nm23) [18], l'uroplakin II (protéine impliquée dans l'étanchéité des épithéliums) [19], l'aquaporine I (aqpI, pompe à transfert d'eau) [20], la PGP 9.5 [21].

Certains marqueurs épithéliaux sont exprimés uniquement dans l'urothélium et les tumeurs chromophobes mais pas dans l'ARCC, comme les cytokératines CK7 et CK20 [22, 23], CK14 [24] ou la vinculine [9]. La Cadhérine E est plutôt restreinte aux épithélium excréto-urinaires [25, 26]. Arai a identifié une protéine dont l'expression est limitée aux tubes de Bellini et qui serait présente dans les carcinomes belliniens [27].

Antigènes nouvellement exprimés par la cellule tumorale rénale (Antigènes associés aux tumeurs ou TAA)

Certaines molécules apparaissent au cours de la transformation tumorale et ne sont pas ou peu présentes sur la cellules saine du tube contourné proximal :

- La vimentine, autre protéine du cytosquelette [22], est un marqueur sensible et spécifique de l'ARCC. Son expression serait significativement associée à un pronostic plus péjoratif [28, 29]. Elle est absente dans l'adénocarcinome chromophobe et dans l'adénome oncocytaire.

- La MRP2 est une pompe de substrats anioniques indépendante de l'ATP, appartenant à la famille des protéines de résistances multiples aux drogues [30]. Elle pourrait jouer un rôle dans le transport des médicaments et dans la résistance à la chimiothérapie.

- une isoforme (TuM2PK) mono ou dimérique de la Pyruvate Kinase, qui est une enzyme glycolytique normalement tétramérique. Son activité sur le Phospho-Enol-Pyruvate est réduite. Cette enzyme peut être détectée dans le plasma de patients porteurs d'ARCC ou de ses métastases (mais également de cancer pancréatique). Elle disparaït après tumorectomie [31, 32].

- des Anhydrases Carboniques (CA) : CA9 [33-35] et CA12 [36, 37] ont été observées dans l'ARCC mais également dans certaines tumeurs comme le poumon et l'estomac ou le côlon [37-41]. La CA 9 pourrait jouer un rôle dans la progression tumorale et la genèse des tumeurs de la maladie de von Hippel Lindau [36]. Inversement, la CA 4 pourrait être exprimée normalement dans le rein sain et diminuée dans l'ARCC [42].

- Nous avons montré qu'un anticorps spécifique (G 250), produit à des fins thérapeutiques [43], permettait de détecter des cellules d'ARCC par cytométrie en flux [44, 45]. L'expression d'ARN messager du gêne correspondant MN/CA9 est détectable par PCR [46, 47]. MN/CA9 semble être un marqueur moléculaire puissant de l'ARCC car il est exprimé dans presque 100% des cas, alors qu'il est absent dans l'adénocarcinome chromophobe, l'adénome oncocytaire et le tissu rénal sain.

- la calpaine est une protéase neutre activée par le calcium [48] ; son expression aurait une valeur pronostique.

- une protéine de choc thermique (HSP 72) serait surexprimée dans l'ARCC [49].

Les tumeurs rénales peuvent exprimer des marqueurs spécifiques des tumeurs prostatiques : PSA [50], prostate membrane antigen (PSMA) [51, 52], kallikréines 1, 3 et KLKI [53]. Ainsi, du PSA a pu être détecté chez des femmes porteuses d'ARCC [54, 55].

Certains marqueurs permettraient de différencier les types tumoraux. Un anticorps, disponible dans le commerce mais encore peu caractérisé (RCCMa®, Novacastra Laboratories Ltd), marquerait l'ARCC et les cancers papillaires mais probablement pas le tissu normal, les tumeurs chromophobes ou les adénomes oncocytaires [15, 56]. De même, la cytokératine 7 serait exprimée dans les tumeurs chromophobes mais pas dans les adénomes oncocytaires [57].

Enfin, comme dans d'autres cancers, la glycosylation des protéines et des mucines peut être anormale dans l'ARCC et concerner :

- des mucines épithéliales acides, anomalie également décrite dans les tumeurs chromophobes et les adénomes oncocytaires [58].

- le disialylosyl galactosyl globoside [59].

- la forme sialylée du Lewis X (CD15s), également surexprimée dans les tumeurs digestives [60-62].

- les galectines 1 et 3 et l'antigène de Thompsen Friedenreich, ligands de la laminine dans la formation de la matrice extra-cellulaire [63].

- la mucine1, dont l'expression dans l'ARCC est liée un pronostic plus péjoratif [3, 64-66].

Par contre, la cellule d'ARCC n'exprime pas à priori d'autres marqueurs épithéliaux tumoraux tels que l'Antigène Carcino-Embryonnaire (ACE), la calrétinine, CA 125, CA19.9, l'Alpha-foeto-protéine [67]. Le c-erbB-2/Her/neu (tyrosine kinase membranaire), très étudié dans le cancer du sein, a été observé dans le rein [68, 69]. Neumann a fait une étude extensive de plusieurs antigènes associés à d'autres tumeurs comme le mélanome [70] et a retenu deux marqueurs (PRAME, RAGE) présents dans au moins la moitié d'un petit nombre d'ARCC étudiés.

Des méthodes d'étude exhaustive des constituants protéiques tissulaires (protéomique) devraient permettre d'identifier d'autres candidats caractéristiques de tissu rénal sain ou tumoral [71, 72]. Quelques résultats sont disponibles sur le site "Swiss-2D PAGE" htpp : //www.expasy.ch:Cgi-bin/map 2.

De même, des études presque exhaustives d'expression différentielle des gènes (differential display, microarray) des tumeurs comparées au tissu sain devraient découvrir de nouveaux candidats dans un avenir très proche.

Marqueurs de désordre génomique

Plusieurs critères peuvent aider à définir le caractère tumoral. Comme nous l'avons vu, la dédifférenciation est marquée par une baisse d'expression des caractères habituels de la cellule.

De nombreuses mutations sur des gènes de fonctionnement (gènes de ménage) de la cellule ont été rapportées (oncogènes) : familles ras [73], bcl2, p53 [74-81], Pax2 [82], Tiam 1 [83], waf /p21 [84]. Le bcl2 est une protéine associée à bax au niveau de la mitochondrie. L'activation de bax par des facteurs de croissance permet la libération de bcl2 qui a une activité de régulation de l'apoptose. Une production excessive de bcl2, mesurable dans le cytoplasme, entraïne une inhibition de l'apoptose augmentant la durée de vie de la cellule. La p53 est impliquée dans les processus de réparation d'ADN au cours de la phase S. De nombreuses mutations ponctuelles ont été décrites au cours du cancer. Ces mutations se traduisent par une inactivation de la p53 et du processus de réparation augmentant ainsi les risques d'erreurs. Le métabolisme de la protéine p53 mutée est altéré et une accumulation est mesurable dans le cytoplasme [73, 85]. Les études de ces oncogènes sont généralement décevantes du fait de l'hétérogénéité tumorale et des difficultés de standardisation des méthodes. Des auto-anticorps anti-p53 ont été observés chez des patients porteurs de tumeurs coliques, ORL, ou pulmonaires [86-88].

Des anomalies peuvent être observées à l'échelon chromosomique (translocations, délétions) directement par hybridation in situ (FISH) [89] ou par détection de translocations chromosomiques (par exemple t3-6, 3-8, 2-3) [90-94].

Ces anomalies peuvent même se traduire par une augmentation (aneuploidie) sensible du nombre de chromosomes [95] ou du contenu en ADN des cellules en phase G0-G1 comparées à la quantité habituelle (diploide).

La cytométrie en flux permet de mesurer finement le contenu d'ADN marqué par un fluorochrome pour chaque cellule et permet de détecter des aneuploidies mais aussi de mesurer la proportion de cellules en phase de prolifération (phase G2-M qui contient le double d'ADN et phase S intermédiaire) [96, 97]. Nous avons observé une grande hétérogénéité intra-tumorale dans l'ARCC [98]. La présence de nombreux 'clones' suggère que ces anomalies seraient très précoces dans le processus tumoral. L'utilisation de la ploidie d'ADN comme marqueur pronostique est confirmée par les données récentes [99, 100].

Les marqueurs chromosomiques (3p) et génétiques (mutation du gène VHL) peuvent être utilisés pour le diagnostic et/ou le pronostic. Sans entrer dans le détail d'anomalies génomiques constitutionnelles caractérisant les formes familiales et héréditaires, nous rappellerons que des altérations du gène VHL sont détectées dans la maladie de Von Hippel Lindau ainsi que dans la majorité des ARCC sporadiques.

Marqueurs des capacités de progression de la tumeur

La progression de l'ARCC dépend de plusieurs processus impliquant des altérations de l'équilibre prolifération-apoptose et l'acquisition des capacités de mobilisation et d'implantation extra-tumorale.

- La vitesse de doublement des cellules tumorales serait augmentée. Les analyses du contenu en ADN indiquent que les cellules en cours de division sont plus fréquentes. Des protéines nucléaires impliquées dans différentes phases du cycle peuvent également être détectées : cyclines [84, 101], Ki67 (anticorps MIB1), PCNA (PC10) [79, 96, 102-106] ou encore les Ag Nor (argyrophilic nucleolar organizer regions) [107]. Les résultats de ces études sont souvent décevants. Pour Brugal, la capacité de croissance tumorale dépendrait moins du nombre de cellules en cycle que de leur vitesse de prolifération (durée du cycle) difficilement mesurable sur une analyse ponctuelle [108]. Les AgNor en seraient le meilleur reflet. Rendom estime que la taille de la tumeur au moment de la découverte dépend plus de la vitesse de croissance que de son ancienneté [109].

- La mort cellulaire (apoptose) pourrait être retardée dans le cancer. Quelques molécules effectrices (caspases) ou régulatrices (bcl2, p53) d'apoptose peuvent être étudiées. L'apoptose peut être induite par le système immunitaire (famille du facteur de nécrose tumorale, TNF) [110] mais nécessite l'expression de récepteurs spécifiques par la cellule tumorale comme le Fas (CD95/Apo1) [110-113]. Une moindre expression pourrait expliquer une résistance de la cellule tumorale à l'immunité anti-tumorale [114]. Inversement, la cellule tumorale peut exprimer des inducteurs d'apoptose (Fas Ligand/CD95-L) [112, 115, 116]. Il existe des méthodes de mesure directe de la fraction cellulaire en cours d'apoptose (condensation chromatinienne, fragmentation d'ADN [TUNEL], inversion de la couche phospholipidique membranaire [Annexine V]) qui ne sont guère interprétables que dans des conditions expérimentales [117, 118].

- Pour que la tumeur puisse subvenir à ses besoins métaboliques croissants, elle doit acquérir la capacité de production de facteurs angiogéniques (EGF, TGGF) mesurables dans les tissus [119, 120].

- Enfin, pour lui permettre d'envahir les tissus proches, la tumeur acquière aussi la capacité de produire des enzymes protéolytiques (métalloprotéases, cathepsine, collagénases, héparinases, urokinases et leurs activateurs) [121]. L'urokinase (uPA), normalement produite par l'épithélium, a la capacité d'activer une sérine protéase plasmatique et des métalloprotéases [122, 123]. Sa production par des cellules tumorales a été montrée pour les tumeurs du sein [124] mais aussi dans l'ARCC [125, 126].

- La cellule tumorale émigrante peut enfin exprimer des molécules d'adhérence qui lui permettront de s'attacher à un endothélium et éventuellement d'envahir un tissu cible pour y fonder une colonie métastatique. Plusieurs molécules ont été analysées : ICAM-1 (CD54) [58, 127], Intégrines, composées d'une chaïne alpha (a2 -CD49b-, a3 -CD49c- ou a5 -CD49e-) et d'une chaïne bêta (b1-CD29) et ELAM [128-130]. Le CD44 est particulièrement intéressant [131-134] car à partir d'un seul gène, plusieurs isoformes peuvent être produites (par épissage alternatif) avec des propriétés adhésives différentes. Les formes V6 [135], V3 [136] ou V8-10 [137] pourraient avoir une valeur pronostique. Des anticorps monoclonaux permettent d'analyser spécifiquement certaines isoformes. La biologie moléculaire peut toutes les différencier selon leur taille. Les formes solubles peuvent également être dosées dans le sang périphérique [138]. Certains glycosides peuvent servir également de ligand tels que Lewis x (CD15), Sialyl Lewis x (CD15s) ou molécule de Thompsen Friedenreich mais leur distribution ubiquitaire (groupes érythrocytaires mineurs) en gêne l'interprétation.

Nous voyons que le nombre de marqueurs disponibles est important. Les modifications sont souvent subtiles et leur signification rarement univoque. Ceci souligne l'absolue nécessité de progresser vers des méthodes d'analyse multiparamétriques et quantitatives.

METHODES D'ANALYSE ACTUELLEMENT DISPONIBLES

Cytométrie en flux (CMF)

La CMF analyse les cellules en suspension (Figure 1).

Figure 1 : Cytométrie en flux. Histogramme : Distribution cellulaire selon l'intensité de fluorescence à l'aide d'un marqueur unique. Mode point : Distribution cellulaire selon l'intensité de fluorescence à l'aide de deux marqueurs utilisés simultanément.

Elle est très couramment utilisée pour la caractérisation des cellules hématopoiétiques. La préparation des échantillons requiert moins d'une heure. Les appareils courants peuvent mesurer jusqu'à 6 paramètres simultanés sur chaque cellule, à grand débit (200-600 cellules/sec). Des appareils encore réservés à la recherche permettent d'analyser un plus grand nombre de paramètres (8 à 12), à plus haut débit (103 à 104 cellules/sec) et même de trier les cellules d'intérêt pour une analyse complémentaire.

L'utilisation de la CMF en cancérologie est limitée par le manque de marqueurs validés et couplés à un fluorochrome disponibles dans le commerce. La CMF permet de détecter une cellule parmi 104 à 106 cellules analysées soit environ 100 à 1000 cellules par ml d'échantillon [139, 140]. Compte-tenu du bruit électronique, il est souhaitable d'analyser au moins 10 à 100 cellules rares pour consolider les résultats, ce qui nécessite des techniques d'enrichissement préalable [141]. La spécificité est très mauvaise sur les cellules mortes ce qui impose de travailler sur prélèvement frais, compliquant singulièrement l'organisation du travail biologique. La méthode de mise en suspension de tumeurs solides est sujette à débat. Une séparation mécanique (la tumeur hachée est passée à travers un tamis de 20 à 50 µm) produit beaucoup de débris cellulaires et des agrégats non analysables. Une séparation enzymatique (trypsine, collagénase, DNAase), un peu plus longue mais plus efficace, peut réduire l'expression de certains marqueurs membranaires. Des chélateurs de cations aident à dissocier les adhésions inter-cellulaires très souvent dépendantes du calcium ou du magnésium.

La cytométrie par scanner propose les même fonctionnalités sur des suspensions dans des puits. Elle pourrait nécessiter moins de cellules. Elle n'en est qu'à ses débuts et requière des validations en diagnostic.

Biologie moléculaire

Elle est d'une extrême sensibilité grâce à la méthode d'amplification exponentielle (réaction polymérase en chaïne ou PCR). Elle peut détecter une seule cellule par échantillon. Cette sensibilité impose des règles strictes pour limiter les contaminations accidentelles par des produits voisins ou d'une manipulation précédente. Les produits doivent être validés par électrophorèse (en gel ou capillaire) et éventuellement hybridation avec des sondes complémentaires spécifiques. La PCR n'est pas limitée par le choix de marqueurs (amorces produites à façon). Les méthodes semi-quantitatives rapides (24 à 48 heures) se développent en diagnostic, notamment virologique. Cependant, la quantité analysée dépend du volume de l'échantillon initial qu'il est très difficile de mesurer de façon fiable. En cancérologie, la détection d'ADN génomique exprimé sur toutes les cellules de l'organisme permet de rechercher des marqueurs constitutionnels (mutations). L'analyse des gènes exprimés se fait sur ARN messager, très labile (quelques minutes à température ambiante ce qui implique un recueil rapide au bloc opératoire) et transcription inverse (RT) (Figure 2).

Figure 2 : RT-PCR

Ces étapes supplémentaires limitent donc considérablement sa sensibilité et nécessitent une nombre initial minimum de 10 à 100 cellules. L'étude simultanée de plusieurs (2 à 6) gènes (PCR multiplex) peut économiser du temps et du matériel mais la détection s'effectue sur un mélange cellulaire, contrairement à la cytométrie qui réalise une analyse multiparamétrique par cellule. Des méthodes séparatives initiales (cytométrie en flux ou séparation magnétique moins coûteuse) peuvent lui être associées.

Protéomique

Les cellules d'intérêt, fraiches, sont éventuellement sélectionnées avant d'être désintégrées et analysées par électrophorèse à deux dimensions selon le point iso-électrique puis la taille. Le gel complexe est analysé avec l'aide de la bio-informatique (Figure 3). Les spots inconnus sont identifiés par spectrométrie de masse et servent à produire des anticorps.

Figure 3 : Protéomique (Les gels d'électrophorèse bidimensionnelle sont analysés à l'aide de l'informatique).

Biopuces

Les biopuces (ou micro-arrays) sont des méthodes d'hybridation (Figure 4).

Figure 4 : Biopuce (ou micro-array). Cette technique permet d'analyser simultanément plusieurs centaines de gènes différents et peut être miniaturisée, d'où le nom de biopuce

Des sondes (le plus souvent d'ADN) sont disposées très précisément sur un support solide. L'ARN est extrait des cellules d'intérêt, fraiches, éventuellement triées, et transcrit de façon inverse en ADN complémentaire comportant un nucléotide radio-marqué ou fluorescent (vert ou rouge). Les produits d'origine tumorale et saine sont alors incubés avec les sondes de puces différentes ou en compétition. Les gènes sous ou sur-exprimés sont identifiés. La révolution technologique vient de la miniaturisation (supports de 12 mm de côté avec possibilités de haute densité (102, 103, 104 gènes testés simultanément). Des méthodes protéines-anticorps sont également en cours de développement. La lecture nécessite un micro-scanner à très haute résolution. L'interprétation n'est pas possible sans l'aide bio-informatique complexe dont les algorithmes restent à développer pour l'ARCC.

Techniques mixtes

Des techniques d'hybridation in situ permettent d'analyser directement les mutations génomiques (ADN). La recherche de l'expression d'ARN messager in situ (RT-PCR in situ) est également possible mais très délicate. Ces deux techniques, associant analyse moléculaire et morphologique, peuvent être utilisées sur des coupes tissulaires ou des cytogrammes. Plus récentes, des techniques de micro-dissection laser permettent d'isoler des cellules suspectes d'une coupe tissulaire pour une analyse complémentaire (PCR). Ces méthodes longues, très délicates et coûteuses ne sont pas encore disponibles pour le diagnostic de routine.

LES APPLICATIONS POTENTIELLES DANS L'ARCC

Figure 5 : Expression d'ARNm MN/CA9 (1) et cadhérine-6 (2) dans l'ARCC T : prélèvement sur pièce d'exérèse ; N : tissu sain ; C : produit de cytoponction percutanée d'ARCC.

La RT-PCR est particulièrement intéressante par sa sensibilité. Un très petit fragment (ponction ou biopsie percutanée) peut être suffisant. Le résultat dépend cependant de la fraicheur de l'échantillon (congelé immédiatement dans l'azote liquide) et de la complexité du mélange cellulaire qui peut être réduite par tri cellulaire préalable. Les méthodes de cytométrie en flux ou en suspension sont adaptées aux fluides biologiques (ie : liquide pleural, péritonéal) mais peuvent être utilisées sur des fragments de tumeur fraiche d'au moins une dizaine de mm3 pour pouvoir être dissociés. Ces techniques pourraient aider à la détermination du caractère malin (MN/CA9 le plus étudié [142], TuM2PK, Calpaine, MRP2, vimentine, mucine, Kallikréines, Rcc Ac) dans certaines tumeurs de diagnostic difficile par l'imagerie (tumeurs de petit volume, kystes atypiques) ou à affirmer l'origine rénale de métastases. On pourrait également rechercher certains facteurs pronostiques comme le degré de différenciation (intensité de marquage de ESA, Cadhérine-6, CD10, CD13, CD26, CD44, APA, calpaine, aquaporine, vinculine), de prolifération (quantité d'ADN, Ki67, PCNA, AgNor), d'apoptose (bcl-2, P53, Caspases) et d'adhérence (ICAM). Certains marqueurs pourraient éventuellement aider à la distinction anatomique de la tumeur : ARCC (positif pour MN/CA9 et RCCMa) et adénocarcinome chromophobe (négatif pour MN/CA9 et vimentine, positif pour CK 7/20) et à les différencier de l'adénome oncocytaire (négatif pour MN/CA9 et vimentine).

Dans l'avenir, les biopuces devraient permettre de caractériser précisément chaque tumeur sur les plans diagnostique et pronostique (oncogènes, molécules de cohésion et d'adhérence) mais également sur leur sensibilité aux traitements adjuvants. Ainsi serait dressée une véritable "carte d'identité moléculaire", complétant une classification nucléaire et TNM dont chacun perçoit les limites dans l'évolution souvent déconcertante et imprévisible de l'ARCC.

Ces méthodes devraient à long terme permettre surtout la détection de cellules tumorales circulantes dans le sang veineux (rénal ou même périphérique). Plusieurs tentatives ont déjà été faites par biologie moléculaire [10, 19, 45, 46, 143] ou cytométrie en flux [139, 140] comme dans les tumeurs prostatiques [144-146] ou mammaires [139, 140]. La problématique de détection d'évènements rares, commune avec d'autres domaines (maladie résiduelle en leucémie et auto-greffe de moelle dans le cancer du sein [139, 140]), fait face à de nombreux problèmes méthodologiques en cours de réflexion. Malgré leur extrême sensibilité, toutes les techniques d'analyse de cellules très rares sont limitées par des facteurs incompressibles: la taille de l'échantillon (5 à 20 ml de sang sont nécessaires pour détecter de façon fiable moins de 10 cellules par ml), le rapport signal/bruit lorsque les cellules normales sont en grand excès par rapport aux cellules tumorales et enfin l'aléa technologique : bruit électronique, contamination. En admettant ces problèmes techniques résolus, la signification pronostique de ces cellules circulantes resterait à déterminer ; elle s'est avérée jusqu'alors décevante dans le cancer de la prostate. Dans l'ARCC, outre la valeur diagnostique devant une lésion rénale atypique ou une métastase de primitif inconnu, on pourrait imaginer que la persistance de cellules circulantes après un traitement à visée curative puisse conduire à un traitement adjuvant précoce, avant même la détection de métastases détectables par les techniques d'imagerie ou, à l'inverse, à l'arrêt d'un traitement adjuvant éprouvant et coûteux jugé inefficace sur ces critères.

CONCLUSIONS

L'identification moléculaire des cellules d'ARCC est désormais possible. L'association cadhérine-6-MN/CA9 nous paraït la plus pertinente pour le diagnostic. D'autres marqueurs pourraient être utilisés pour augmenter la spécificité, prendre en compte l'hétérogénéité tumorale et affiner les facteurs pronostiques qui restent, à l'heure actuelle, grossiers. Les qualités de la cytométrie en flux : rapidité, analyse quantitative et multiparamétrique sont intéressantes pour l'utilisation diagnostique et pronostique sur prélèvement tumoral. La biologie moléculaire, probablement plus adaptée à la détection d'évènements très rares est, par sa sensibilité et sa spécificité, plus attractive pour les applications cliniques et d'importants développements technologiques sont en cours. L'établissement d'une "carte d'identité tumorale" de l'ARCC est pour demain. Pour l'heure, chaque technique doit encore être validée et les seuils diagnostiques pour un rapport sensibilité/spécificité optimum et reproductible restent à définir dans les conditions de routine. Les progrès techniques et technologiques permettent d'être optimiste. La solution sera certainement multiparamétrique et composite. Remerciements

Nous remercions Le Comité de la Loire de La Ligue Nationale Contre Le Cancer et la Délégation Régionale à la Recherche Clinique du CHU de Saint-Etienne pour leur appui financier.

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